摘要
猪圆环病毒（Porcinecircoviruses,PCVs）是圆环病毒科、圆环病毒属中的成员，包括PCV1、PCV2、PCV3和PCV4。其中，PCV2被视为猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）中的主要病原体，可侵害宿主的淋巴组织，引起机体的免疫抑制，从而导致继发或混合感染其他病原体，使感染猪群的临床症状加剧。PCV2通过口腔和鼻腔等呼吸道黏膜入侵机体，随后到达全身各处。黏膜免疫系统是机体防御病原入侵的第一道屏障，主要依赖多聚免疫球蛋白受体（Polymericimmunoglobulinsrecepter,pIgR）和新生儿Fc受体（NeonatalFcreceptor,FcRn）介导SIgA、IgM和IgG转运到黏膜表面发挥作用。因此，开展PCVs的分子流行病学调查以及PCV2感染仔猪后对pIgR和FcRn表达的影响及其致病性研究具有重要意义。目前取得主要研究结果如下： 1.广东省部分地区PCVs分子流行病学调查 本研究利用PCR方法对2017~2023年期间从广东省韶关、清远、广州、佛山、东莞、阳江、茂名、江门及中山共9个地区收集的193份临床样本进行PCVs检测。结果显示：PCV2、PCV3感染率以及PCV2与PCV3混合感染率分别为56.48%、8.81%和8.81%，但未检测到PCV4。此外，本研究发现PCV2除了与PCV3混合感染外，还与几种常见病毒混合感染。结果显示：在PCV2阳性样本中，PCV2与猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒和猪瘟病毒混合感染率分别为23.85%、18.35%、9.17%和0.92%；PCV2与上述病毒的双重感染率、三重感染率和四重感染率分别为33.94%、14.68%和1.84%。综上所述，PCV2常与其他病原发生混合感染，且多为双重或三重感染。 本研究共获得80株PCV2毒株的全基因组序列和7株PCV3毒株的全基因组序列以及5株PCV3毒株的ORF2基因序列。经同源性分析发现，本研究获得的PCV2毒株与GenBank中参考毒株的全基因组、ORF1基因以及ORF2基因的核苷酸同源性分别为90.1%~99.9%、96.0%~100%和80.0%~99.4%，Rep蛋白与Cap蛋白的氨基酸同源性分别为96.2%~100%和79.5%~100%；本研究获得的PCV3毒株与GenBank中参考毒株的全基因组、ORF1基因以及ORF2基因的核苷酸同源性分别为98.5%~99.9%、98.9%~100%和97.2%~99.7%，Rep蛋白与Cap蛋白的氨基酸同源性分别为98.8%~99.9%和96.7%~100%。基于PCV2的全基因组和PCV3完整编码序列的遗传进化分析，本研究获得的PCV2毒株分为PCV2a、PCV2b和PCV2d三个基因亚型，而PCV3毒株分为PCV3a和PCV3b两个基因亚型。其中，PCV2d（75.0%）和PCV3b（71.43%）为主要基因亚型。 2.PCV2的分离鉴定及致病性分析 本研究在PK-15细胞上成功分离出一株PCV2d亚型毒株，命名为PCV2/CN/GD/2022/12（GenBank登录号：OR480471）。将分离到的PCV2毒株感染断奶仔猪，发现部分感染仔猪表现咳嗽、打喷嚏、腹泻等临床症状。通过qPCR方法揭示了仔猪感染后可出现病毒血症。通过qPCR方法检测肺脏、肾脏、腹股沟淋巴结、气管等组织的病毒载量，证实PCV2具有广泛的组织嗜性，且在腹股沟淋巴结的病毒载量最高。病理切片显示，PCV2可引起腹股沟淋巴结和脾脏淋巴细胞减少、间质性肺炎、肝细胞空泡样变性、肾血管球体积缩小、肾上皮细胞透明样变性、气管纤毛受损和上皮细胞脱落等病理变化。 3.pIgR多克隆抗体的制备及PCV2对仔猪pIgR和FcRn表达的影响 本研究以pET-28a（+）和pGEX-KG为载体成功构建了pET28a-pIgR和KG-pIgR重组质粒，并利用原核表达系统成功表达了His-pIgR和GST-pIgR融合蛋白。进一步将纯化的GST-pIgR融合蛋白免疫兔子。将纯化的His-pIgR融合蛋白作为包被抗原，通过ELISA方法检测制备的pIgR多克隆抗体的效价为1∶102,400。WesternBlot结果显示，制备的pIgR多克隆抗体能够特异性识别细胞pIgR蛋白。 本研究利用qPCR方法检测健康仔猪和感染仔猪pIgR和FcRn在mRNA水平的表达情况。结果显示：与正常对照组相比，PCV2感染后14d和28d，肺脏、肾脏、肠道（空肠和盲肠）中pIgRmRNA表达水平均极显著下调，而气管中却极显著上调。与正常对照组相比，PCV2感染后14d和28d，肝脏、肾脏、肺脏、肠道（空肠和盲肠）、气管中FcRnmRNA表达水平均极显著下调，而脾脏中FcRnmRNA表达水平却呈现先上升后下降的趋势。为了进一步探究PCV2对呼吸道和消化道黏膜中pIgR和FcRn表达的影响，利用WesternBlot方法检测健康和感染仔猪的气管和肠道（空肠和盲肠）pIgR和FcRn在蛋白水平的表达情况。结果显示：与正常对照组相比，PCV2感染后14d和28d，气管和肠道（空肠和盲肠）中pIgR和FcRn蛋白表达水平均呈下调趋势。 综上所述，本研究对广东省部分地区开展了PCVs分子流行病学调查和遗传进化分析，为PCVs防控和诊断提供了参考数据；同时，本研究成功分离了一株PCV2，将毒株感染仔猪表明其具有一定的致病性；并发现PCV2对仔猪黏膜组织pIgR和FcRn表达有影响，这丰富了病原突破黏膜屏障入侵机体的分子机制，为黏膜免疫基础理论的研究奠定了基础。
NETL