摘要
目的探索盐诱导激酶1（SIK1）通过Runt相关转录因子2（RUNX2）调控成骨分化和软骨下骨重塑，进而抑制骨关节炎的作用。 方法选取2022年6月至2023年6月期间于宁夏医科大学总医院在骨三科接受全膝关节置换术的60名原发性膝关节OA患者，收集患者的临床信息和胫骨平台组织样本。行非标记（Label-free）定量蛋白质组学分析SIK1的差异表达，免疫组织化学染色（IHC）观察SIK1及成骨分化相关标志因子，RUNX2、碱性磷酸梅（ALP）、成骨相关转录因子（OSX）、骨钙素（OCN）在OA软骨下骨中的表达情况，并通过Hamp;E染色、番红O固绿染色、Masson染色及茜素红染色观察OA晚期软骨下骨的形态学特征。同时使用6周龄C57BL/6小鼠提取骨髓间充质干细胞（BMSCs）并通过流式细胞术对其进行鉴定，然后诱导其向成骨细胞分化，蛋白免疫印迹（Westernblotting）、实时荧光定量PCR（RT-PCR）和ALP染色探究SIK1对成骨细胞分化相关因子的调控作用，以及RUNX2在成骨分化中的作用，并通过慢病毒转染技术过表达SIK1、CADD522抑制RUNX2表达及Muramyldipeptide（MDP）激活RUNX2表达，探究SIK1和RUNX2在BMSCs成骨分化中的作用。然后选取了96只雌性C57BL/6小鼠，使用内侧半月板失稳术（DMM）构建小鼠膝关节OA模型。随机分组后腹腔注射PhangininA（PA）诱导SIK1的过表达，CADD522和MDP抑制或激活RUNX2的表达。8周后通过番红O固绿染色OARSI分级、Hamp;E染色及Masson染色评估小鼠膝关节软骨的退变程度，微型计算机断层扫描（μ-CT）分析小鼠膝关节软骨下骨重塑情况。 结果（1）人体组织实验部分：60名患者的年龄、BMI、术前VAS疼痛评分、Lysholm评分、西大略和麦克马斯特大学（WOMAC）骨关节炎指数评分和KellgrenLawrence（K-L）分级分析结果均符合OA的流行病学特征。Label-free定量蛋白质组学分析结果显示，SIK1在晚期OA患者的软骨下骨中较对照组相比，表达量显著降低（P＜0.05）。IHC结果也表明OA晚期患者的软骨下骨中的成骨分化相关标志因子的表达均显著升高（P＜0.01）。组织学染色结果显示OA软骨下骨板和骨小梁增厚。 （2）体外实验部分：根据原代细胞流式细胞术结果分析，细胞表面CD90（97.9%＋）、CD105（99%＋）、CD34（0.074%-）、CD45（0.03%-），符合BMSCs的生物学特征。CCK-8实验结果提示，CADD522和MDP处理BMSCs的最佳浓度为200μM和10μM。诱导BMSCs成骨分化的0到14天内，SIK1的转录和翻译水平呈时间依赖性逐渐下降，成骨相关基因如RUNX2、ALP、OSX和OCN的表达水平和ALP染色活性均显著增加（P＜0.05）。在BMSCs的成骨分化过程中抑制RUNX2表达后，观察到OSX、ALP和OCN转录和翻译水平及ALP染色活性显著降低（P＜0.01）。过表达SIK1并抑制RUNX2表达后观察到SIK1的转录和翻译水平显著增加（P＜0.001），而RUNX2呈相反的趋势，同时成骨相关标志物的表达和ALP染色活性显著降低（P＜0.01）。将SIK1和RUNX2同时过表达观察到RUNX2的转录和翻译水平较抑制组显著变化（P＜0.01），但是SIK1的变化没有统计学差异（P=0.072）。同样在SIK1过表达的条件下，RUNX2过表达导致成骨相关标志物的表达水平和ALP染色活性显著增加（P＜0.01），与RUNX2抑制组相比有显著差异（P＜0.05），但是仍未达到单纯诱导分化组的水平。 （3）体内实验部分：番红固绿染色结果显示，与假手术组相比，DMM组的OARSI评分显著增加（P＜0.001）。Hamp;E染色显示，DMM组的HC变薄，CC增厚，软骨表面出现广泛的损伤，粗糙且不平滑。μ-CT分析显示，DMM组术后8周出现明显的软骨下骨硬化，BV/TV、Tb.N和BMD显著增加，Tb.Sp显著减少（P＜0.001）。与DMM导致的软骨损伤相比，过表达SIK1的小鼠在DMM8周后表现出病理染色的显著改善：OARSI评分降低（P＜0.01），CC厚度减小（P＜0.001），HC厚度增加（P＜0.001），μ-CT结果也表现为缓解OA进展的趋势，与DMM组相比，BV/TV、Tb.N和BMD减少，Tb.Sp增加（P＜0.05）。在过表达SIK1时抑制RUNX2的表达较过表达RUNX2的DMM小鼠的软骨破坏和软骨下骨硬化得到了显著的改善。 结论SIK1通过RUNX2抑制成骨细胞分化，调控骨关节炎晚期软骨下骨重塑，进而抑制OA的发生发展。
NETL