摘要
目的探讨甘松饮（Gan-songYin,GSY）对糖尿病肾病（diabetickidneydisease，DKD）的治疗作用及相关作用机制。 方法 1.通过CCK-8法确定棕榈酸（Palmiticacid，PA）的造模浓度，检测PA对小鼠肾足细胞（MPC5）增殖的影响，以及GSY对造模后的细胞增殖的影响；利用流式细胞术检测GSY干预PA诱导的细胞凋亡情况和细胞周期的变化，以及细胞活性氧的检测和记录细胞线粒体膜电位的变化。 2.通过Westernblot法检测PA对足细胞损伤标致蛋白Podocin、Nephrin的影响；以及GSY对自噬和凋亡相关蛋白（SIRT1、Beclin1、p62、LC3、BAX、BCL-2、Caspase3、Cleaved-Caspase3）的作用。 3.利用Westernblot法检测加入自噬抑制剂氯喹(CQ)后LC3-Ⅱ以及p62的蛋白表达变化；并进一步转染mRFP-GFP-LC3串联荧光蛋白腺病毒，检测细胞内自噬流的变化。 4.通过GSY联合SIRT1抑制剂EX-527和激动剂白藜芦醇（RES）检测细胞周期及细胞凋亡的变化，并利用Westernblot法检测GSY对SIRT1的影响，以及SIRT1对凋亡和自噬的影响。同时，转染mRFP-GFP-LC3串联荧光蛋白腺病毒，检测不同干预对细胞内自噬流的影响。 结果 1.CCK-8检测结果：与对照组相比，PA呈浓度依赖性的抑制MPC5细胞的增殖。与模型组相比，GSY可促进细胞的增殖，且在6g/L的时候细胞活率最好，作为后续实验条件。 2.流式结果显示PA的诱导促进了细胞的凋亡，并将细胞周期阻滞于G2/M期，ROS明显增加，线粒体膜电位下降。与模型组相比，GSY处理后减少了细胞的凋亡和ROS的水平，上调了线粒体膜电位，并缓解了PA对于细胞周期G2/M期的阻滞。 3.Westernblot的结果显示，与对照组相比，PA诱导可上调p62、LC3、BAX、Caspase3、Cleaved-Caspase3的蛋白表达，下调Podocin、Nephrin、SIRT1、Beclin1、BCL-2的蛋白表达。与模型组相比，GSY干预后p62、LC3、BAX、Caspase3、Cleaved-Caspase3的蛋白表达下降，SIRT1、Beclin1、BCL-2的蛋白表达升高。加入CQ处理后，CON+CQ、PA+CQ、GSY+CQ组p62、LC3蛋白的表达均较各自未加CQ组的有所上升。转染mRFP-GFP-LC3串联荧光蛋白腺病毒后，进一步动态说明了GSY干预抑制PA导致的自噬流受阻，从而促进自噬。 4.EX-527组的细胞凋亡率较PA组进一步增加，且加重对细胞周期G2/M期的阻滞。Westernblot的结果显示，EX-527干预后抑制了SIRT1、BCL-2的蛋白表达，增加了p62、LC3、BAX、Caspase3、Cleaved-Caspase3的蛋白表达，而RES的干预结果则与之相反。转染mRFP-GFP-LC3串联荧光蛋白腺病毒后，显示EX-527可抑制细胞内自噬通量，而GSY的加入促进了自噬通量。 结论 1.PA诱导可通过抑制足细胞的增殖，增加细胞的凋亡率，阻滞细胞的周期于G2/M期，增加ROS的过度生成，造成足细胞的损伤。 2.PA诱导的细胞凋亡可能是通过抑制SIRT1的活性，增加p62及LC3的蛋白表达，进而抑制自噬实现的。 3.GSY可通过减轻线粒体损伤，减少ROS的生成，上调SIRT1的蛋白表达，减少p62及LC3的蛋白表达，抑制PA诱导的足细胞损伤。并结合自噬抑制剂CQ和SIRT1抑制剂、激动剂进行处理，进一步验证了GSY可通过激活SIRT1调控自噬，抑制足细胞的凋亡，改善DKD的症状。
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