摘要
植物萜类化合物在植物抵御昆虫胁迫过程中发挥着重要作用，是包括玉米、水稻等粮食作物用以绿色防控害虫的关键物质之一。前期研究表明，玉米单萜合成酶（Terpenesynthese,TPS）基因表达量的提高能够释放更多的单萜类化合物，但单萜的合成也受到底物的限制，只提高TPS表达量的方式具有局限性。目前在玉米萜类合成通路中大量的TPS基因已经被鉴定，但同样作为调控萜类合成的关键基因，异戊烯基二磷酸合成酶（Isopentenylpyrophosphatesynthase,IPS）中仅法呢基焦磷酸合成酶（Farnesylpyrophosphatesynthase,FPPS）在倍半萜烯合成中的功能被报道，关于香叶基焦磷酸合成酶（Geranylpyrophosphatesynthase,GPPS）相关的研究较少。本研究基于玉米第五代基因组和实验室原有的转录组数据，鉴定了来自ZmIPS基因家族的12个基因，筛选出虫害诱导后显著上调的2个基因并进行了表达模式和亚细胞定位分析；同时对这2个候选基因进行了序列分析及基因功能的验证；通过酵母双杂和分子对接技术，对候选基因的复合体构型进行了预测和验证，并且筛选了候选基因与底物结合的关键氨基酸位点，研究结果为阐明玉米萜类合成机制及其在植食性昆虫的绿色防控中的应用提供理论基础。主要研究结果如下： （1）玉米ZmIPS基因家族的鉴定及表达模式分析。从玉米基因组中鉴定出12个IPS基因，包括5个香叶基香叶基焦磷酸合成酶（Geranylgeranypyrophosphatesynthase,GGPPS）基因，3个FPPS基因，2个茄呢基焦磷酸合成酶（Solanesylpyrophosphatesynthase,SPPS）基因以及2个葵烯基焦磷酸合成酶（Decaprenylpyrophosphatesynthase,DPPS）基因，其中GGPPS又分为GGPPS大亚基（Largesubunit,LSU）和GGPPS小亚基（Smallsubunit,SSU）两个亚类。系统发育分析结果表明，GGPPS和FPPS基因具有明显聚类现象，但GGPPS亚族基因已经出现了明显功能分化的现象。从转录组数据中筛选出2个虫害诱导后上调的基因ZmGGPPS2和ZmGGPPS3，组织表达谱分析结果与转录组分析结果一致，但虫害诱导后2个候选基因在茎中表达量均显著高于叶片中的表达量，亚细胞定位实验显示2个候选基因均定位于叶绿体。上述结果表明ZmGGPPS2和ZmGGPPS3可能在玉米萜类合成途径中发挥着重要功能。 （2）玉米ZmGGPPS2和ZmGGPPS3蛋白表达和功能分析。利用无缝克隆构建包括pET28a(+)、pCZN1、pMAL-c2x在内的3个表达载体，分别对包涵体和上清表达蛋白进行复性及纯化，然后利用超滤浓缩，亲和层析等方式制备可溶性ZmGGPPS2和ZmGGPPS3异源表达蛋白。体外酶促反应分析表明，包涵体复性后的蛋白质不再具备天然酶活性，而纯化后的上清表达蛋白具有酶学活性，并且ZmGGPPS3可以催化异戊烯基二磷酸（Isopentenylpyrophosphate,IPP）和二甲基丙烯基二磷酸（Dimethylallylpyrophosphate,DMAPP）生成香叶基焦磷酸（Geranylpyrophosphate,GPP），而ZmGGPPS2主要生成香叶基香叶基焦磷酸（Geranylgeranypyrophosphate,GGPP），仅产生微量的GPP。说明ZmGGPPS3只发挥GPPS酶活性催化产生GPP，而ZmGGPPS2则是具备GGPPS和GPPS催化活性的双功能酶。 （3）ZmGGPPS2和ZmGGPPS3复合体构型及关键氨基酸的初步探究。通过共转pGBKT7-ZmGGPPS3+PGADT7-ZmGGPPS3载体（ZmGGPPS2同理）在四缺板上正常生长且变蓝色。同时，基于Alphafold-Multimer构建的复合体结构与已报道物种晶体结构叠合比对RMSD值分别达到了0.623、0.532和0.807，结构高度重合。基于Autodockvina软件，对ZmGGPPS2和ZmGGPPS3可能的催化底物DMAPP、GPP和FPP等进行分子对接分析，筛选出包括Glu133、His136和Arg155等在内的结合口袋附近的关键氨基酸残基。上述研究结果表明ZmGGPPS2和ZmGGPPS3可能具备同源二聚体的复合体构型，并且Leu110和Val106在ZmGGPPS2和ZmGGPPS3催化机制中可能发挥着重要功能。
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