摘要
番茄（SolanumlycopersicumL.）因其独特的风味和良好的品质深受消费者的喜爱，番茄的食用器官为果实，对于番茄的研究往往集中在对于果实大小和品质的研究，对于番茄种子的研究较少，而种子大小与种子内营养物质含量密切相关，对于幼苗发育有直接影响，同时种子也是产生和储存植物激素的主要器官，对于果实发育也有影响。因此，对于番茄种子的研究具有重要意义。本研究主要通过全基因关联分析（GWAS）和基于转录组的混池测序分析（BSR-Seq）定位调控番茄种子大小的主效基因，同时利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对候选基因进行功能验证，具体结果如下： 1.454份番茄自然群体材料的种子千粒重全基因组关联分析结果显示，调控种子千粒重的两个主效基因定位在2号染色体末端43.2-53.8Mb和12号染色体中部37.4-37.5Mb区间内，其中在2号染色体上有80个显著性SNP位点，在12号染色体上有14个显著性SNP位点，在这两个区间内挑选了候选基因：SlGH3.4、SlP450、SlNUP、SlMAPK和SlULP1。 2.种子长度关联分析将调控种子长度的基因定位在2号染色体末端43.7-53.8Mb区间内，与种子千粒重在2号染色体上的定位区间重叠，其中在2号染色体共有51个显著性SNP位点，在此区间内挑选基因：SlGH3.4、SlP450、SlNUP、SlCABP和SlMAPK。 3.候选基因SlGH3.4启动子序列在不同品种番茄材料中存在107bp的变异，绝大部分栽培番茄缺失该序列，野生番茄含有该序列，启动子序列存在缺失的材料种子偏大，而含有该序列的材料种子偏小。通过对多毛番茄渐渗系群体种子千粒重测量并调查发现，在2号染色体末端，含有多毛番茄该渗入片段的IL系LA3923种子千粒重较小，而不含该片段的IL系LA3921和LA3924种子千粒重较大。这表明，在这些野生番茄2号染色体末端存在调控种子千粒重的基因，验证了关联分析结果。 4.根据潘那利番茄渐渗系IL2-5亚系种子千粒重，以及分子标记位置，将调控种子千粒重的基因定位在2号染色体末端51.9-52.9Mb区间内。 5.根据醋栗番茄和栽培番茄杂交后代分离群体中535个分离单株的种子千粒重，构建了种子极端大和极端小的幼苗RNA混池，进行BSR-Seq测序分析，结果显示在12号染色体0-546824bp内发现明显的峰，说明12号染色体也存在调控种子大小的基因。进一步分析显示，在大小种子不同材料中有129个差异表达基因，其中有56个基因在大种子中上调表达，73个基因下调表达。KEGG和GO富集分析显示，这些差异表达基因主要富集在氧化还原途径和氮代谢途径。 6.超量表达候选基因SlGH3.4造成植株严重矮化，顶端生长点卷曲，节间距缩短，严重影响番茄植株的发育，证明SlGH3.4是番茄植株生长发育的负调控基因。外源喷施NAA能够部分恢复SlGH3.4超量植株的表型，但是存在剂量效应。利用CRISPR/Cas9敲除SlGH3.4后植株形态没有发生明显改变，但是编辑植株后代种子长度变长，千粒重增加，证明SlGH3.4参与调控番茄种子大小和千粒重。 7.亚细胞定位结果显示，SlGH3.4是在细胞膜和细胞核中行使功能。GUS染色结果表明，SlGH3.4在番茄叶片的叶脉、叶缘和根中表达。
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