摘要
氧化亚氮（N2O）是一种在大气存留时间长且破坏臭氧层的重要温室气体。农业土壤源N2O是其重要来源，具有产生路径广、影响因素多、调控复杂等特点。最新研究表明，接种具有N2O还原能力的植物根际促生菌（Plantgrowthpromotingrhizobacteria，PGPR）是减少N2O排放和促进作物生长的重要手段。针对目前存在的N2O减排效应的PGPR菌株数量有限、减排土壤N2O的根际微生物学机制不清及调控技术缺乏的问题，本研究筛选到一株具有良好促生和减排特性的PGPR—施氏假单胞菌NRCB010。通过温室盆栽试验研究PGPR对作物生长和减排土壤N2O的影响，并揭示PGPR减排土壤N2O的微生物学机制。进一步探索根系分泌物成分对NRCB010减排土壤N2O的调控作用。最后自主研发功能微生物筛选趋化装置，明确人工合成菌群减排土壤N2O效应。主要研究内容如下： 1．筛选获得一株具有促生、耐盐脱氮和N2O还原能力的PGPR—施氏假单胞菌NRCB010。从根际土壤中分离得到7株候选菌株，均具有产生长素、溶磷和产铁载体的能力。平板促生试验表明，NRCB010和NRCB026对番茄促生效果最好，干重分别提高了58.1%和53.2%。进一步评估表明，NRCB010和NRCB026具有较高的耐盐脱氮能力以及广泛的耐碱性和碳素利用范围。在初始pH7.0、葡萄糖为碳源的DM培养基中，NRCB010和NRCB026对NO3–-N的去除率最高。此外，接种NRCB010和NRCB026加速了农业沟渠水和鱼塘水中氮的去除。根据16SrRNA序列鉴定NRCB010为Pseudomonasstutzeri。根据16SrRNA、gyrA和gyrB序列鉴定NRCB026为Bacillusvelezensis。其中，NRCB010成功扩增出nosZ基因，具有N2O还原酶活性。 2．明确PGPR对作物生长和减排土壤N2O的影响，揭示PGPR减排土壤N2O的根际微生物学机制。以施氏假单胞菌NRCB010为供试菌株，施氏假单胞菌NRCB025为对照菌株，温室盆栽试验表明，接种NRCN010和NRCB025显著促进细质土壤和粗质土壤中番茄和苜蓿的生长。以番茄为供试作物时，接种NRCB010减少细质土壤和粗质土壤N2O排放量，分别减少38.7%和52.2%，接种NRCB025减少粗质土壤N2O排放量，减少了76.6%。但以苜蓿为供试作物时，接种NRCN010和NRCB025并不能土壤N2O排放量。说明NRCN010和NRCB025具有良好的促生和减排土壤N2O的能力，但减排N2O的强度受土壤性质、PGPR特异性和作物种类的影响。进一步通过Meta16SrRNA测序和qPCR方法分析显示，接种NRCB010和NRCB025主要通过改变番茄土壤微生物群落组成和氮循环功能基因的丰度来减少N2O排放。其中，接种NRCN010和NRCB025对土壤N2O减排作用可部分用（amoA+amoB）/（nosZI+nosZⅡ）和（nirS+nirK）/（nosZI+nosZⅡ）比值的降低来解释。结构方程模型表明，土壤pH和SOM是解释氮循环功能基因丰度变化以及随后N2O排放的关键变量。 3．研究NRCB010与番茄根系分泌物互作。水培试验表明，一定浓度的NRCB010菌体促进了番茄的生长，番茄根系分泌物显著增加了NRCB010的生物量、涌动性和生物膜的形成。此外，NRCB010没有改变番茄根系分泌物组成但改变了根系分泌物成分相对含量，其中11种成分的相对含量发生了显著变化。筛选出与NRCB010涌动性和生物膜形成显著相关的4种代谢物。进一步评估表明，2，4-二叔丁基苯酚、棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯在适当浓度下增加了NRCB010的生长、涌动性、趋化性和生物膜形成，但在测试浓度下抑制了NRCB010在番茄根际的定殖能力。适当浓度的棕榈酸增加了NRCB010的生长、趋化反应、生物膜形成和根际定殖能力。 4．明确根系分泌物成分对NRCB010减排土壤N2O的调控作用。在纯培养试验中，硬脂酸甲酯显著提高了NRCB010脱氮和N2O还原能力。棕榈酸显著提高了NRCB010生长素含量、脱氮、N2O还原能力和N2O还原酶活性。在微宇宙和温室盆栽试验中观察到单独添加棕榈酸减少土壤N2O的排放，分别减少了34.3%和46.6%。与NRCB010联合使用进一步减少了土壤N2O的排放。此外，棕榈酸或与NRCB010联合使用显著促进了番茄的生长。棕榈酸或与NRCB010联合使用改变了微生物生成环境，以直接或间接方式逐步调控根际与N2O产生和还原相关的关键微生物群落的构建，从而达到减排土壤N2O的目的，主要表现为：在有利于硝化和反硝化作用的环境条件（高土壤pH和SOM）下抑制N2O的产生（降低AOB和nirK基因丰度）和促进N2O的消耗（增加nosZⅡ基因丰度）来减少土壤N2O的排放。 5．自主研发功能微生物高效筛选趋化装置，明确人工合成菌群减排土壤N2O效应。通过设计简易的趋化装置模拟对照、NRCB010、棕榈酸以及棕榈酸和NRCB010联合使用招募远端土壤微生物到宿主根际的运动过程，提高了根际关键功能微生物的筛选效率。在预测的基础上结合纯培养技术筛选并构建合成群落。微宇宙和温室盆栽试验显示，与SCControl相比，接种SCNRCB010、SCHac和SCNR_H减少了土壤N2O排放，这说明构建的合成群落具有减排土壤N2O的能力。此外，各合成群落和对应同批原生处理（SCControl和Control组、SCNRCB010和NRCB010组、SCHac和Hac组以及SCNR_H和NR_H组）两者之间土壤N2O排放量没有显著差异。这说明我们构建的合成群落包含了原处理微生物群落中与减排土壤N2O相关的关键功能微生物。 综上所述，本文以促生、耐盐脱氮和N2O还原能力为依据筛选到一株PGPR—施氏假单胞菌NRCB010，明确其促生和减排土壤N2O的能力，并揭示驱动PGPR减排土壤N2O的关键根际环境因子。明确根系分泌物成分对NRCB010减排农田土壤N2O的调控作用。最后自主研发功能微生物高效筛选趋化装置，明确人工合成菌群减排土壤N2O效应。研究结果将为更好地开发土壤微生物资源，研制土壤N2O减排的环境友好型制剂提供理论和实践支撑。
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