摘要
过氧化氢(hydrogenperoxide,H2O2)是重要的电化学检测活性物质，也是生物体内众多氧化酶催化反应的产物，如葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase,GOX)和胆固醇氧化酶(cholesteroloxidase,COD)等。因此，在酶生物传感检测领域可以通过电化学测定H2O2含量，间接测定多种目标物质的含量，在发酵组分检测与过程监控领域有着重要应用潜力。为明确微生物发酵过程中的底物浓度、关键中间代谢物浓度、产物浓度提供了一种新的检测手段，可为全面评估发酵过程和微生物响应状态，阐明发酵机制，优化调控策略，提升发酵效率提供重要意义。 然而，当前大部分酶生物传感器只能针对单一组分物质进行检测，应用范围窄，难以满足对微生物发酵过程多组分浓度参数的实时监测。聚吡咯（Polypyrrole,PPy）作为一种氮原子和碳原子共存的导电大分子，具有导电性好、制备方便等优点，使得基于PPy衍生的Fe-N掺杂的碳纳米纤维（Fe-Ndopedcarbonnanofibers,Fe-N-CNFs）成为一种非常有前景的传感纳米材料，陆续开发出一系列具有高电催化活性的单原子催化金属纳米酶，丰富了氧化还原反应(oxygenreductionreaction,ORR)催化剂种类。因此，本文基于聚吡咯碳纳米线，设计合成了一种铁基单原子纳米酶(Fe-SASC/NW)，在不同工作电压下，具有较高的H2O2与NADH电催化活性和稳定性。进一步负载葡萄糖氧化酶和乙醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase,ADH)后，获得了可以同时响应葡萄糖和乙醇的传感电极，并实现对微生物发酵过程中葡萄糖底物和乙醇产物的同步实时监测，主要结果如下： 一、Fe-SASC/NW材料的合成、表征及电化学性能研究：通过在聚吡咯碳纳米线中掺杂铁原子，合成了铁基单原子催化型碳材料Fe-SASC/NW，并对其进行表征。结果表明Fe-SASC/NW呈线状结构，赋予了较大的比表面积和丰富的纳米孔结构，且材料表面存在大量的铁原子位点。检测发现Fe-SASC/NW对H2O2和NADH都具有较高的电催化活性。在工作电压为+0.1V，对0.05-2mmoL/L的H2O2底物具有良好的线性范围，最低检测限为0.02mmol/L(S/N=3)，灵敏度为69.45μA/(mmol?L-1?cm2)；在工作电压为+0.4V，对NADH底物的检测线性范围为0.05-2.5mmoL/L，检出限为0.01mmol/L(S/N=3)，灵敏度为167.97μA/(mmol?L-1?cm2)。抗干扰实验进一步表明，Fe-SASC/NW对H2O2和NADH具有良好的选择性。 二、负载酶的Fe-SASC/NW电化学表征：在合成的Fe-SASC/NW纳米酶传感材料基础上，首先通过壳聚糖分别固定葡萄糖氧化酶和乙醇脱氢酶得到两个可以独立检测葡萄糖和乙醇的生物传感电极，对浓度为0.05-1.2mM的葡萄糖底物和5-80mM的乙醇底物具有良好的检测线性关系。随后，优化确定了两种酶的共固定化方法，通过切换工作电压，获得可以同时检测葡萄糖和乙醇的电化学生物传感器。在+0.05V的工作电压下，传感电极对5-35mM浓度范围内的葡萄糖具有良好的线性电流响应，最低检测极限为3mM。在+0.2V的工作电压下，对5-60mM浓度范围内的乙醇表现出良好的线性电流响应，最低检测极限为2mM。 三、GCE/Fe-SASC/NW/GOX/ADH双酶电极在乙醇发酵过程监控的应用：为了进一步测试所构建双酶生物传感器在同时检测微生物发酵体系中葡萄糖和乙醇浓度变化的应用潜力，以Saccharomycescerevisiae好氧补料分批发酵生产乙醇的发酵过程为研究对象，监测了发酵过程中细胞的生长情况、葡萄糖消耗和乙醇产量的变化。结果表明，葡萄糖浓度随着细胞的快速生长而逐渐降低，同时伴随着乙醇浓度的不断升高。将使用生物传感器同步检测的底物葡萄糖和产物乙醇的浓度数据与高效气相色谱法检测的结果进行拟合，两者的数据相关系数分别高达87.3%和94.1%，且所制备的生物传感器检测两种组分之间不会产生互相影响，证明双酶电极可以实现对发酵组分中葡萄糖和乙醇的快速精准的检测。 综上所述，本文制备了一种基于铁基单原子纳米酶的电化学酶生物传感器，负载葡萄糖氧化酶和乙醇脱氢酶后，通过切换工作电压实现了葡萄糖和乙醇浓度的同步检测。同时，所设计的双酶生物传感器，在对微生物发酵生产过程中葡萄糖和乙醇的双组分样品浓度变化的快速监测方面具有一定应用潜力。
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