摘要
乳铁蛋白（Lactoferrin，LF）是转铁蛋白家族的一种80kDa铁结合糖蛋白，在牛奶和大多数生物体液中含量丰富。除了直接的抗菌特性外，乳铁蛋白还具有抗病毒、抗氧化、免疫调节等活性，被广泛应用于食品、医药和化妆品行业中。乳铁蛋白众多的健康益处和广泛的潜在应用导致了对乳铁蛋白的需求显著增长。然而，当前从牛奶及其副产物中直接分离纯化乳铁蛋白的方式无法满足市场需求。随着合成生物学技术的发展，利用微生物工程菌在反应器中大量生产乳铁蛋白的方法已经成为研究热点。目前已经有一些尝试，在细菌、真菌和动物表达系统中进行乳铁蛋白的异源表达，大多数研究都能成功表达，但普遍存在表达量低、生产成本高等问题。因此，深入探索一种高效、安全、量产的乳铁蛋白表达系统是未来的重要研究方向。本课题主要以牛乳铁蛋白为研究对象，通过表达宿主筛选和牛乳铁蛋白功能性片段表达，实现了牛乳铁蛋白在解淀粉芽孢杆菌中的分泌表达。进一步通过合成生物学手段对基因表达元件、菌株进行改造并通过发酵工程技术建立了一条高效的发酵工艺路线，为发酵法生产牛乳铁蛋白提供了可行性方案。具体的研究内容分为以下三个方面： （1）以E.coliBL21(DE3)为重组蛋白表达宿主、pET28a为重组蛋白表达载体，构建重组菌E.coliBL21/pET28a-BLF，SDS-PAGE结果显示，重组菌在预测大小位置出现明显的目的蛋白条带，进一步通过对重组牛乳铁蛋白功能片段进行质谱鉴定，确定牛乳铁蛋白在大肠杆菌中成功表达。然后对重组菌中牛乳铁蛋白的蛋白表达形式进行分析，发现牛乳铁蛋白在大肠杆菌表达系统中主要以不溶性包涵体形式存在，约占总蛋白表达量的66%。考虑到蛋白折叠、包涵体复性、蛋白纯化、食品安全等问题，利用大肠杆菌表达牛乳铁蛋白的成本效益并不高。 （2）通过分泌表达宿主筛选、牛乳铁蛋白功能片段的分段表达，以初始表达量为评价标准，确定分泌表达宿主菌B.amyloliquefaciensSE和全长牛乳铁蛋白的适配度最高。为了提高牛乳铁蛋白在解淀粉芽孢杆菌中的异源表达水平，进一步在翻译、分泌和折叠等方面进行了系统性优化：①在RBS序列优化方面，构建具有不同翻译强度的重组菌，结果表明，R2和R9使牛乳铁蛋白浓度增加了44.4%和22%。②在信号肽优化方面，挖掘到了源自植酸酶的一种新型分泌信号肽序列，并成功用于解淀粉芽孢杆菌中牛乳铁蛋白的分泌表达，使得目的蛋白的浓度提升了28.8%。进一步对冗余蛋白植酸酶进行敲除，提高了胞外牛乳铁蛋白的纯度。③通过共表达胞质外分子伴侣PrsA，提高了胞外目的蛋白浓度，使牛乳铁蛋白的表达量提升至48.4±0.7mg/L。 （3）对优化后的重组工程菌进行发酵过程的调控，对接种量、培养基条件和诱导表达条件进行优化。确定最佳接种条件：接种种龄11h、接种量2%。确定最适培养基配方：甘油0.4%v/v、酵母粉24g/L，蛋白胨15g/L，亮氨酸7g/L、柠檬酸铁0.06g/L、K2HPO412.5g/L，KH2PO42.3g/L（pH=7）。最佳诱导表达条件：诱导温度26℃、诱导剂浓度0.2mMIPTG、诱导剂添时间4h。摇瓶发酵体系的优化，使胞外蛋白浓度达到89.0±0.5mg/L，与未优化前相比提升了1.85倍。然后进行了从摇瓶发酵到5L发酵罐放大的研究，目的蛋白产量在发酵30h时最高，达到了110.0±0.8mg/L，相比摇瓶发酵产量提高了23.5%。本研究为发酵法制备牛乳铁蛋白提供可行性方法。
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