摘要
化石燃料的大量消耗和环境污染的日渐加重，使得生物质原料的能源化和资源化使用更加普遍。木质纤维素是世界上最宝贵的生物质，其中纤维素是由葡萄糖残基通过β-1,4-糖苷键结合而形成的多聚体，可降解成单糖，再由微生物发酵，转化生成生物能源和其他化学品。但由于木质纤维素本身具有高度复杂的抗降解结构，以及木质素对纤维素酶的非生产性吸附，大大增加了纤维素降解和转化的难度。在木质纤维素酶解过程中添加某些非催化蛋白可减少这种非生产性的吸附作用。本实验室前期研究发现，将苋菜叶片蛋白加入木质纤维素酶解反应体系可以显著提高纤维素酶解效率，并通过质谱分析鉴定了苋菜叶片中的29种蛋白质。本研究筛选了其中的AH24、CYP76、GAPDH、Q5UAW5、RBCS（核酮糖二磷酸羧化酶小亚基）和RPS12共6种蛋白。通过异源表达方式，研究其对纤维素酶解的作用，并初步探索了作用机理。结果如下： 1.AH24、CYP76、GAPDH、Q5UAW5、RBCS和RPS12这6种蛋白均为亲水性蛋白；其中AH24和Q5UAW5等电点小于7，属于酸性蛋白，其余四个蛋白的等电点大于7，属于碱性蛋白；六个蛋白的二级结构均以α螺旋和无规则卷曲为主，β转角最少；六个蛋白的三级结构差异较大。 2.分别选用pET-28a、pGEX-6P-3、pET-28a-SUMO三种原核载体构建蛋白重组表达载体。其中pET-28a-SUMO-AH24、pET-28a-SUMO-RBCS、pET-28a-SUMO-Q5UAW5和pET-28a-SUMO-RPS12表达出可溶性目的蛋白。 3.RBCS蛋白与纤维素酶有明显协同作用。RBCS蛋白对0.5%（w/v）NaOH预处理水稻秸秆的酶解有显著增效作用。在纤维素酶浓度仅为1g/L的体系中，添加RBCS蛋白后，酶解效率增加了18.1%，而添加等量的苋菜叶片蛋白，无法达到相同效果。且酶解后的上清液中的纤维素酶的浓度更高，RBCS蛋白的添加会减少纤维素酶的损失，而这种作用是通过减少纤维素酶对底物的非生产性且不可逆的吸附实现的。与直接添加苋菜叶片蛋白相比，实现了单一蛋白的微量高效辅助作用。 4.RBCS蛋白与木质素有较强吸附作用。木质素可吸附RBCS蛋白，且在5min内即可实现完全吸附，通过测定木质素Zeta电位的变化发现，这种吸附主要是通过静电力相互作用，木质素与RBCS蛋白以静电力相结合，从而减少木质素与纤维素酶的非生产性吸附。 5.RBCS蛋白会降低木质素的疏水性。添加2mLRBCS蛋白后，木质素的水接触角从57.6°减小至40.2°。即RBCS蛋白的添加，降低了木质素的疏水性。推测是木质素由于静电相互作用力结合的RBCS蛋白形成水合层。该水合层使亲水基团暴露，从而降低了生物质样品的疏水性，促进底物分散并提高生物质的比表面积，从而增加纤维素酶对底物的可及性。
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