摘要
1,5-戊二胺作为聚酰胺5X的单体，是重要的化学中间体，在材料领域可用于多种新型材料及高聚物的制备。木质纤维素生物质是储量丰富、廉价易得的可再生资源，其水解产物主要为葡萄糖与木糖。若能对木质纤维素水解液中的可发酵糖加以利用，实现1,5-戊二胺的高效合成，不仅解决了废弃物处理问题，又降低了1,5-戊二胺的生产成本，形成循环经济模式。为了获得可同步利用五六碳糖的重组大肠杆菌，实现以木质纤维素为原料生产1,5-戊二胺，本研究在高产赖氨酸大肠杆菌的基础上，首先考察赖氨酸脱羧酶表达方式对1,5-戊二胺合成的影响，进而通过强化内源木糖异构酶途径提升菌株对木糖的代谢速率，获得了可利用木糖合成1,5-戊二胺的一步发酵菌株；为实现该菌株对五六碳糖的同步利用，本研究解除了碳分解代谢物阻遏（CCR）并强化了产物合成相关途径，最终成功将玉米秸秆水解液应用于1,5-戊二胺的生产。研究主要内容如下： （1）木糖合成1,5-戊二胺一步发酵菌株的构建。以大肠杆菌NT1003为出发菌株，通过赖氨酸脱羧酶(CadA)、木糖异构酶途径关键酶（XylAB）表达优化研究以期构建一株可快速代谢木糖合成1,5-戊二胺的重组大肠杆菌。首先对赖氨酸脱羧酶的表达方式进行优化，通过基因组整合、质粒形式分别对赖氨酸脱羧酶编码基因cadA进行组成型或诱导型表达，结合产物产量与发酵时长，确认以质粒形式组成型表达cadA时，1,5-戊二胺产量最高，为3.36g/L；随后为提升菌株对木糖的代谢速率，强化大肠杆菌内源木糖异构酶途径，发现xylAB的过表达使菌株对木糖的消耗速率提升16.67%，生长延滞期缩短，1,5-戊二胺产量较过表达前增加了42.86%，达到4.80g/L；最后对xylAB的表达水平进行优化，发现改用高拷贝质粒pTRC99A过表达木糖利用基因xylAB可使菌株的木糖代谢速率与1,5-戊二胺合成能力进一步提升，进而成功获得木糖合成1,5-戊二胺一步发酵菌株。 （2）葡萄糖与木糖同步利用菌株的构建与调控。以CadA、XylAB最优表达菌株为出发菌株，通过碳分解代谢物阻遏（CCR）的解除与产物合成相关途径的强化以期获得一株可同步代谢葡萄糖与木糖高效合成1,5-戊二胺的重组大肠杆菌。首先基于大肠杆菌CCR机制，通过CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除葡萄糖特异性转运膜透性酶编码基因ptsG，该菌株的葡萄糖消耗速率较敲除前降低33.33%；强化葡萄糖辅助摄取途径（GalP/Glk），菌株的生长与葡萄糖代谢不再受阻，但产物合成能力严重受损，不适宜作为后续实验菌株；随后通过混合碳源摇瓶发酵研究证明ptsG敲除菌株在不同比例的混合碳源中都可实现对葡萄糖与木糖的同步消耗，但产物产量受葡萄糖占比严重影响，表明混合碳源中木糖的有效利用率较低；故提升磷酸戊糖途径代谢通量与细胞还原力的供应，成功使1,5-戊二胺产量提升至4.76g/L,较改造前提升27.31%，最终获得一株同步代谢葡萄糖与木糖合成1,5-戊二胺的重组大肠杆菌。 （3）重组菌株同步利用五六碳糖生产1,5-戊二胺过程优化。通过发酵培养基组分优化、发酵罐放大工艺的建立与水解液的发酵预处理以期将玉米秸秆水解液应用于1,5-戊二胺的生产。为了进一步提升1,5-戊二胺产量，首先考察了不同比例的混合碳源与无机氮源、氨基酸的浓度对重组菌株合成1,5-戊二胺的影响，确认重组菌株的最佳发酵生产条件；同步优化发酵罐培养基组分后对菌株的培养进行放大验证，重组菌株发酵全程可实现葡萄糖与木糖的同步利用，1,5-戊二胺产量为60.74g/L，转化率达到34.32%；最后对两种不同碳源比例的玉米秸秆水解液进行脱毒处理，减轻了副产物对菌株的抑制作用。随后使用1.5L发酵罐放大培养，1,5-戊二胺产量分别为15.96g/L、24.42g/L，成功将玉米秸秆水解液应用于1,5-戊二胺的发酵生产。
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