摘要
1,6-己二胺作为一种重要的有机化合物，广泛应用于尼龙66、尼龙610的生产，同时也可作为固化剂和有机交联剂用于二异氰酸酯、脲醛树脂和环氧树脂的合成。传统的1,6-己二胺合成依赖于石化资源密集型的化学方法，不仅能耗大、反应条件苛刻、生产工艺长，而且原料可再生性差，存在环境污染风险，不符合绿色可持续发展的要求。因此，寻求绿色、高效的生物合成方法以替代传统的化学法合成，已成为实现经济与环境可持续性的首选策略。本研究以来源广泛的6-氨基己酸为底物，通过元件适配组装构建1,6-己二胺合成路径，并结合微生物发酵和全细胞催化过程强化以提高工程菌株1,6-己二胺产量。通过研究得到以下结论： (1)高产1,6-己二胺大肠杆菌菌株的构建。首先，对羧酸还原酶(CAR)同工酶进行酶活测定，获得对6-氨基己酸活性最高的突变体MABCARL342E，其相比于野生型，酶活提高了5.95倍。在此基础上，结合转氨酶(TA)同工酶进行元件适配组装，构建了CAR-TA级联模块，通过摇瓶发酵菌株DAH4(MABCARL342E-HATA)1,6-己二胺产量最高达到3.01mg·L-1；为了强化转氨酶的转氨能力，引入双转氨酶，构建了CAR-TA-TA级联模块，通过摇瓶发酵菌株DAH37(MABCARL342E-VFTA-PatA)1,6-己二胺产量最高达到8.50mg·L-1。 (2)1,6-己二胺摇瓶发酵过程强化。通过底物浓度、初始糖浓度、诱导时间、发酵时间的优化来强化菌株DAH4和DAH37摇瓶发酵1,6-己二胺的生产能力。当底物浓度8g·L-1、初始糖浓度2g·L-1、诱导剂IPTG添加时间1.5h(DAH4)/3.5h(DAH37)、发酵时间96h时，菌株DAH4和DAH37的1,6-己二胺产量最高，分别达到64.33mg·L-1和153.93mg·L-1，较优化前分别提高了20.36倍和17.11倍。 (3)高产1,6-己二胺全细胞催化体系的构建。基于1,6-己二胺人工合成途径建立全细胞催化体系，通过CTAB处理细胞强化物质的传输效率，并结合工程菌株的构建和催化过程强化来提升1,6-己二胺生物合成能力。首先，通过元件适配性组装，获得了最优的全细胞催化工程菌株DAH4，1,6-己二胺产量达到0.42g·L-1，是摇瓶发酵产量的6.53倍；为了强化转氨能力，引入双转氨酶进行全细胞催化，菌株DAH27(MABCARL342E-HATA-CVTA)的1,6-己二胺产量最高达到0.66g·L-1，是摇瓶双转氨酶菌株DAH37发酵产量的4.29倍。 (4)1,6-己二胺全细胞催化过程强化。对菌株DAH4和DAH27生产1,6-己二胺的全细胞催化过程进行强化。得到两株菌最优催化条件：pH7.5、温度30℃、ATP浓度4mmol·L-1(DAH4)/5mmol·L-1(DAH27)、NADPH浓度2mmol·L-1、细胞密度OD600为30、在3.0h(DAH4)/4.0h(DAH27)进行诱导、诱导后蛋白表达时间为21h(DAH4)/19h(DAH27)、CTAB浓度170mg·L-1、底物浓度10g·L-1、氨基供体浓度20mmol·L-1。最终，菌株DAH4和DAH27全细胞催化9h的1,6-己二胺产量分别达到3.61g·L-1和2.37g·L-1，较最初产量分别提高了1198.34倍和277.82倍，并且缩短了90%的转化时间。
NETL