摘要
红景天苷及其苷元酪醇，具有抗辐射、抗缺氧、抗疲劳、抗肿瘤、抗氧化等丰富的生理活性，在医疗、美容、食品等行业得到了广泛的利用。目前依靠天然提取法或化学合成法获取红景天苷及酪醇已无法满足日益增长的市场需求，近年来，生物法合成红景天苷及酪醇成为研究热点，但依然存在产量低、生产成本高的问题。 在本研究中，筛选了高效的糖基转移酶，利用蔗糖合酶构建了尿苷二磷酸葡萄糖(uridinediphosphateglucose，UDPG)循环再生体系，为了进一步降低生产成本，引入了高效的酪醇生产途径，实现以L-酪氨酸为底物微生物法合成红景天苷及苷元酪醇。主要研究内容包括以下几点： (1)筛选了不同来源的糖基转移酶与蔗糖合酶，在大肠杆菌中成功实现了异源表达。其中来源于红景天UGT33的比酶活最高，为1.36±0.04U·mg?1，来源于拟南芥AtSUS的比酶活最高，为10.13±0.02U·mg?1，因此选择利用UGT33进行酪醇的糖基化，并利用AtSUS构建UDPG循环再生体系。 (2)利用分子改造的手段提升UGT33的酶活，通过丙氨酸扫描突变获得了能使酶活提高的6个有益位点，分别是H29A、T158A、H271A、Y311A、Q375A、Q415A，其中T158A突变株相对酶活最高，达到WT的123.41%；双突变株T158A/Y311A较WT相比酶活力提升到了137.31%，为15种组合突变体中的最优突变体。 (3)为改善酶的表达情况并协调UGT33与AtSUS的催化效率，针对共表达载体构建进行了优化，确定以TB培养基作为诱导表达培养基。菌株E.coliS9在底物酪醇30mmol·L-1，蔗糖35mmol·L-1，UDP8mmol·L-1，体系中添加5mmol·L-1Mn2+以及1%曲拉通X-100，菌体OD600=30，在30℃、140r·min-1、pH7.0的最优条件下于5L发酵罐上进行全细胞催化，红景天苷产量最高达到9.02g·L?1。 (4)为进一步降低生产成本，引入了酪醇合成途径。通过比较两条酪醇生物合成途径，选择粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)来源酪氨酸脱羧酶EfTDC以及藤黄微球菌(Micrococcusluteus)来源酪胺氧化酶MlTYO作为酪醇生物合成途径的关键酶。在底物L-酪氨酸浓度10g·L?1，体系中添加0.5mmol·L-1NADP+及1%曲拉通X-100，菌体OD600=30，在30℃、140r·min-1、pH7.0条件下进行全细胞催化，重组菌E.coliT1转化效率最高，酪醇产量3.60g·L?1，转化率可达到47.21%。 (5)将EfTDC、MlTYO、UGT33、AtSUS四酶以双质粒共表达的方式构建了多酶共表达菌株E.coliTS01，该菌株于5L发酵罐上进行全细胞催化，红景天苷产量最高达到4.98g·L?1，酪醇的积累量为1.55g·L?1。 综上所述，本研究成功构建重组大肠杆菌并以L-酪氨酸为底物高效合成红景天苷，同时为其他糖苷类化合物的合成提供一定的参考意义。
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