摘要
乳铁蛋白（Lactoferrin，LF）是一种具有多种功能的铁结合糖蛋白，由哺乳动物的乳腺上皮细胞表达和分泌。LF是乳中不可或缺的一种活性蛋白成分，其具有多种生物学功能，如参与机体铁代谢、广谱抗菌活性及抗氧化活性等。LF已被广泛应用于临床、医药及婴幼儿配方奶粉等领域。然而，对LF的开发与应用主要聚焦于牛LF（BovineLactoferrin，BLF），关于山羊LF（CaprineLactoferrin，CLF）和绵羊LF（OvineLactoferrin，OLF）的研究较少。但CLF、OLF与人类LF（HumanLactoferrin，HLF）也具有高度同源性，羊乳也是人类除牛乳以外的主要乳源，其丰富的LF资源对于羊乳基婴幼儿配方奶粉的配方优化至关重要。开发和利用来自羊乳的CLF和OLF，其首要步骤是实施高效的分离纯化技术。因此亟待开发CLF和OLF的分离纯化技术，不仅为LFs的工业化生产及深加工提供了理论指导，也有助于推动羊乳产业的发展。 此外，乳制品加工中，热处理是必不可少的加工单元，主要用于杀死乳中的微生物，保证食品的安全以及货架期。但热处理会对LFs的结构和功能活性产生不利影响。而LFs中铁饱和度的不同也会影响LFs的结构、热稳定性、抗菌性及抗氧化性等功能特性。因此，探究铁饱和度对热处理后BLF、CLF及OLF的结构、热稳定性及功能活性的影响，可以为产品研发中的工艺选择优化和活性成分保护带来了更多的可能性，从而使LFs更好的应用于婴幼儿配方乳粉中。 本研究使用牛、山羊和绵羊成熟乳为原料，分离纯化得到天然LFs，建立了不同铁饱和度LFs的模型，对其理化性质和结构进行测定。同时，本研究对不同铁饱和度LFs进行了10min的不同温度（65℃、75℃及85℃）热处理，比较了铁饱和度对热处理后LFs结构、热稳定性、抗菌及抗氧化活性的影响。本文的主要研究结果如下： （1）不同乳源乳铁蛋白的分离纯化及热稳定性研究：采用离子交换层析（CM-SepharoseFastFlow）从乳清中纯化出BLF、CLF和OLF，OLF再次通过凝胶过滤层析（SephacrylS-100HR）进行二次纯化。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、反相高效液相色谱（RP-HPLC）及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOFMS）成功鉴定蛋白及其纯度，BLF的纯度为98.23%，CLF为99.47%，OLF为99.58%。建立了LFs的不同铁饱和度模型，发现Holo-CLF和Holo-OLF只能达到60%左右的铁饱和度。同时，Native-CLF的铁饱和度最低，为9.09±1.26%；Native-BLF为15.25±1.29%，Native-OLF最高为28.79±1.8%。随着铁饱和度的增加，LF红色和黄色的强度逐渐升高。光谱结果显示，三个物种的Native-LF的二级结构含量未有显著差异，且铁饱和度的变化对它们的二级结构没有显著影响，而影响其三级结构。铁饱和度的升高使LFs的结构更为紧密，且增强了LFs的热稳定性。Native-CLF其主要变性温度峰位于85.65℃，其热稳定性可能相对较高。 （2）铁饱和度对热处理后不同乳源LFs结构及热稳定性的影响：随着热处理温度升高，LFs之间发生蛋白质聚集，浊度逐渐变大，疏水区大量暴露于LFs表面，表面疏水性升高。LFs二级结构中α-螺旋含量均有所下降，β-折叠及无规卷曲含量均显著上升。荧光光谱结果表明，热处理后，高铁饱和度的LFs内部的色氨酸暴露于外部的极性环境中，最大吸收波长红移，荧光强度增强；而低铁饱和度的LFs表现出荧光光强度降低，这是由于其表面较多的色氨酸被受热产生的大量蛋白质聚集物包裹。随着温度的升高，LFs的表面形貌由光滑的片状结构转变为丝状或球状结构。铁饱和度的升高增强了LFs的热稳定性，Holo-LFs的蛋白聚集程度、浊度、二级结构、三级结构及表面疏水性的变化程度小于Apo-LFs。在三个物种中，Apo和Native形式下CLF受热变化程度较小，表现出最强的热稳定性。而Holo-CLF和Holo-OLF在65℃和75℃弱于60%-BLF，而在85℃强于60%-BLF。 （3）铁饱和度对热处理后不同乳源LFs抑菌作用的研究：对于大肠杆菌及其生物膜的生长，仅有Apo-CLF和Native-CLF具有显著的抑制作用。而对于李斯特菌及其生物膜的生长，Apo和Native形式下的CLF和BLF对其均有显著的抑制作用，且CLF抑制作用强于BLF。Holo-LFs均不具有抑制作用，铁饱和度的升高降低了LFs的抑菌活性。相比较CLF对李斯特菌及其生物膜生长的抑制，CLF对大肠杆菌及其生物膜生长的抑制作用对热更敏感，更易被破坏。菌落超微结构的变化表明CLF和BLF的抑菌活性的机制可能归因于LF与细菌表面直接相互作用，导致细胞膜或细胞壁被破坏，从而使细胞内容物渗漏和死亡。铁饱和度的升高降低了LFs对DPPH自由基的抑制率。未经过热处理的Apo和Native形式下CLF对DPPH自由基的抑制率是最高的。随着温度的升高，Apo-LFs和Native-LFs的抗氧化性逐渐下降，而Holo-LFs耐热性更高，能够维持一定的抗氧化性。 综上所述，三个物种的Native-LF的二级结构含量未有显著差异，且铁饱和度的变化对它们的二级结构没有显著影响，而影响其三级结构。铁饱和度的升高使LFs的结构更为紧密，增强了LFs的热稳定性，降低了LFs的抑菌活性。在三个物种中，Apo和Native形式下CLF表现出最强的热稳定性。同时，CLF的抗氧化活性及其对大肠杆菌和李斯特菌的抑菌活性均高于BLF和OLF。本研究结果有利于LFs更好的应用于婴幼儿配方乳粉中。
NETL