摘要
石榴酸是一种含有三个共轭双键的十八碳烯酸，具有抗癌、抗肥胖、抗氧化、抗炎等活性，在食品和医药行业具有很高的应用价值。自然界中的石榴酸普遍以甘油三酯的形式存在于石榴(Punicagranatum)种子油中。目前石榴酸的获取方法主要是植物提取法，但受限于石榴生长周期长且环境依赖性强。石榴酸也可通过化学合成法获得，但步骤繁琐、产率低、成本高，难以进行商业化推广。随着合成生物学的发展，人们可以基于基因编辑工具，利用性能优越的微生物实现各种特定化合物的合成。近年来，各种改造解脂耶氏酵母的合成生物技术手段蓬勃发展，使该酵母成为生产功能性脂肪酸的优势平台。 本论文利用合成生物学改造解脂耶氏酵母，引入了异源的石榴酸合成途径，并对该途径及酰基编辑和油脂积累途径进行了优化，最终实现了石榴酸的有效合成。本研究主要结果如下： （1）解脂耶氏酵母中石榴酸合成途径的构建 以高产油酸(C18∶1Δ9)的2Pg2E菌株作为底盘细胞，过表达解脂耶氏酵母内源的Δ12去饱和酶基因(YlFAD2)，以提高石榴酸合成前体亚油酸(C18∶2Δ9,12)的积累，工程菌株AZ-0-1中亚油酸含量占总脂肪酸的25.27%。后通过引入两个拷贝的石榴来源脂肪酸共轭酶基因(PgFADX)，以催化前体亚油酸转化为石榴酸，工程菌株AZ-2可积累占总脂肪酸0.78%的石榴酸，脂质含量达到细胞干重的13.06%，实现了解脂耶氏酵母中石榴酸从无到有的积累。 （2）解脂耶氏酵母中石榴酸合成途径的优化 在AZ-2菌株中继续整合两个拷贝的PgFADX表达盒，以进一步提高脂肪酸共轭酶的异源表达水平，工程菌株AZ-4中石榴酸含量可提高至总脂肪酸的2.01%。此外，胞质中生成的油酸酰基辅酶A需转移至磷脂酰胆碱(PC)中，从而由YlFad2催化PC形式的油酸发生去饱和生成亚油酸，后PgFadx催化PC形式的亚油酸发生共轭生成石榴酸。通过过表达内源的胆碱磷酸转移酶，推动二酰基甘油形式的石榴酸前体转化成PC形式。接着通过引入不同植物来源的溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶基因以加强酰基在酰基辅酶A池和PC池的交换，从而增加去饱和和共轭的反应机率，并且使PC形式的石榴酸释放至酰基辅酶A池中。工程菌株AZ-6可积累占总脂肪酸3.60%的石榴酸，脂质含量达到细胞干重的19.09%。 （3）解脂耶氏酵母中油脂积累途径的优化 通过比较不同来源磷脂-二酰基甘油酰基转移酶对不同脂肪酸的偏好性，以促进PC形式的石榴酸积累至甘油三酯中。此外，过氧化物酶体关键发生因子PEX10的敲除可以有效破坏β氧化途径，阻断酰基辅酶A降解，进一步提高脂质积累。通过敲除FAD+依赖的3-磷酸甘油脱氢酶基因和过表达NAD+依赖的3-磷酸甘油脱氢酶基因，以促进3-磷酸甘油的合成，为油脂积累提供充足的骨架。工程菌株AZ-14的脂质积累含量达到细胞干重的37.35%，是底盘菌株2Pg2E的3倍，石榴酸滴度达到73.10mg/L。对最优菌株AZ-14进行5-L发酵罐培养132h，菌株生物量最高可达到71.50g/L，油脂含量可达细胞干重的76.84%，石榴酸滴度最高可达3072.72mg/L。
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