摘要
β-半乳糖苷酶能够降解乳糖，可以在乳制品工业中用来生产低乳糖牛乳。激烈热球菌（Pyrococcusfuriosus）来源的β-半乳糖苷酶BgaS相较其他来源的乳糖酶具有更好的耐热性和更合适的pH范围，在乳制品工业中具有良好的应用前景。为了实现更安全的分泌表达，本研究以枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）为表达宿主，在BacillussubtilisWB800的基础上，通过CRISPR-Cpf1基因编辑系统构建了具有高效分泌能力且不含任何抗性标记的重组菌BS801，再以此为宿主通过信号肽筛选的方法成功在胞外检测到了BgaS。此外，以壳聚糖为载体实现了BgaS的固定化，从而进一步提高了其稳定性和耐热性，为固定化BgaS在乳制品工业中的潜在应用提供了一些理论参考。具体研究内容如下： 首先，本研究利用CRISPR-Cpf1基因编辑系统对BacillussubtilisWB800的基因组进行改造。设计了三条针对BacillussubtilisWB800三种外源抗性标记（ble，hyg和bsr）的crRNA序列。将crRNA序列与对应的同源臂序列同时插入质粒，构建了三个重组质粒pcrF11-ble-del、pcrF11-hyg-del和pcrF11-bsr-del，同含有表达Cpf1蛋白的质粒pHT-XCR6构成双质粒编辑系统，逐个敲除三种外源抗性标记。经验证，在后培养后基因编辑的效率为100%。最终消除所有外源质粒。构建了不含有任何外源抗性标记的重组菌BS801。 其次，为了实现BgaS在枯草芽孢杆菌中的异源表达，构建了大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pXHD1.1。以BS801为表达宿主，通过NCBI检索得到BgaS基因序列，构建了pXHD1.1-bgaS表达质粒，成功在枯草芽孢杆菌中异源表达了BgaS。BgaS的最适反应温度为90℃，最适反应pH为7.0与牛乳的pH相近。并且BgaS具有良好的耐热性，在80℃下孵育3h后相对酶活几乎没有下降。为了进一步降低生产成本，在此基础上，本试验尝试在枯草芽孢杆菌中实现BgaS的分泌表达。通过参考软件预测结果和文献报道，筛选了十种不同Sec途径的枯草芽孢杆菌来源的信号肽，分别接在质粒pXHD1.1-bgaS中目的基因的N端，构建对应的重组质粒和重组菌，经过发酵后，收集发酵上清液。发酵上清液的SDS-PAGE验证和酶活测试结果表明含信号肽SPdacB、SPnucB、SPyoaW和SPpel的重组菌在胞外检测到了BgaS，其中信号肽SPdacB的效果最好，胞外酶活达到0.42U/mL。并且通过对十种信号肽的性质与其对分泌的引导作用的分析，推测对BgaS而言，在一定范围内，信号肽的H区疏水性与其对分泌的促进效果存在正相关。 最后，以壳聚糖微球为载体实现了BgaS的固定化及应用。本试验优化了壳聚糖微球的合成条件，确定最适壳聚糖浓度为0.04g/mL。并且本试验同样对固定化条件进行了优化，确定戊二醛浓度26.50g/L，交联温度35℃，交联时间2.5h，酶添加量5.94U/mL为最适固定条件。优化后，在最适条件下固定化酶的酶活回收率达55.11%。此外，固定化酶的酶学性质相较游离酶也有提高。固定化酶的最适反应温度和最适反应pH与游离酶相同，但是固定化酶具有更好的pH耐受性，在相同pH环境下，固定化酶的相对酶活较游离酶普遍提升了18.23%以上；并且固定化酶的耐热性较游离酶也有所提升，在95℃条件下孵育90min仍保有80%以上的相对活性，较同条件下的游离酶提升了11.31%。固定化酶具有一定的可重复利用率，在连续使用了5次以后，固定化酶的活力仍保持在80%以上，最终利用固定化酶来降解牛乳中的乳糖，尝试制备低乳糖牛乳，经验证，在最适条件下处理3h即可使牛乳中乳糖含量降低至0.5%以下，达到无乳糖宣称。 本试验以BacillussubtilisWB800为出发菌株，利用CRISPR-Cpf1基因编辑系统构建了不含外源抗性标记的表达宿主BS801，在此基础上，筛选出了四种可能能够引导胞内酶BgaS分泌表达的信号肽，在枯草芽孢杆菌的胞外检测到了BgaS。最后，利用壳聚糖微球为载体构建了固定化酶，测试了固定化酶的乳糖降解能力，实现了低乳糖牛乳的制备。为后续BgaS的潜在工业化应用提供了理论基础。
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