摘要
甜菊糖苷是一种高甜度、低热量、安全可靠的天然甜味剂，但其结构中含有的甜菊醇苷元会导致后苦味，影响了甜菊糖苷在食品和药品等领域的广泛应用。甜菊糖苷的味觉特性主要受C-13位和C-19位糖基的种类、数量及空间构象影响，因此，对甜菊糖苷的C-13和C-19位进行糖基化修饰是减少后苦味、改善味质的有效策略之一。但目前糖基化方法普遍存在产率低、选择性差等缺点，因此发展高产率、高区域选择性的糖基化新策略迫在眉睫。尿苷二磷酸糖基转移酶(UGTs)以尿苷二磷酸糖为糖基供体，可高效和高选择性地构建O-、C-和S-糖苷。本研究利用芝麻(Sesamumindicum)来源的糖基转移酶UGT94D1和栀子(Gardeniajasminoide)来源的糖基转移酶UGT94E13，分别在莱鲍迪苷D(RebD)的C-19位和C-13位选择性地引入葡萄糖基，成功合成了莱鲍迪苷M2(RebM2)和一种新型甜菊糖苷衍生物莱鲍迪苷M8(RebM8)。此外，通过定向进化对UGT94D1和UGT94E13的催化活性进行提升，与拟南芥(Arabidopsisthaliana)来源的蔗糖合酶AtSuSy构建级联反应体系，实现了RebM2和RebM8的高效制备，并对它们的味觉性质和生物活性进行了初步评价。主要研究结论如下： 1.利用糖基转移酶UGT94D1高选择性地实现了RebM2的高效合成 为解决RebM2制备存在的选择性差、产率低的问题、实现RebM2的高效合成，利用芝麻来源的糖基转移酶UGT94D1对RebD进行选择性糖基化，成功制备了RebM2，并通过液相色谱-质谱(LC-MS)以及一维、二维核磁对其结构进行了确认。但UGT94D1对RebD的催化活性较低(Km=0.89±0.05mM，kcat=0.33±0.08s-1)，因此通过定向进化对其活性进行了提升。利用Alphafold2预测了UGT94D1的晶体结构，并基于分子对接对底物周围可能与其具有相互作用的氨基酸进行分析，选取了20个氨基酸残基进行定向进化，获得了最佳突变体UGT94D1-F119I/D188P。相较于野生型，催化活性提高至6.33倍。利用分子对接和分子动力学模拟，对其催化活性提升的机制进行了解析。在UGT94D1-F119P/D188P中，氨基酸残基H20的?位的氮原子与RebD上糖基I的C-6位羟基氢原子之间的距离相较于UGT94D1明显缩短；Op-C1p-O6角度相较于UGT94D1增大，更有利于RebD糖基C-6位羟基发生去质子化，从而显示更高的催化活性。 2.利用糖基转移酶UGT94E13高选择性地实现了RebM8的高效合成 为了进一步改善甜菊糖苷的味觉性质并开发具有广泛应用价值的莱鲍迪苷M(RebM)异构体，利用一种来源于栀子的糖基转移酶UGT94E13对RebD进行葡萄糖基化修饰，实现了一类新型甜菊糖苷衍生物的合成。通过化学结构表征，对其萜烯骨架、相对立体化学、葡萄糖残基的位置、构建及连接方式进行了研究，确认该衍生物的化学结构为在RebD的C-13位引入一个葡萄糖基，将其命名为RebM8。随后，研究了UGT94E13的酶学性质和动力学参数。其最适pH为8.0，最适反应温度为35℃；以RebD为底物的Km为0.23?0.02mM，kcat为0.45?0.02min-1，揭示了后续通过定向进化提高其催化活性的必要性。使用Alphafold2对UGT94E13的蛋白结构进行了预测，并结合分子对接，对蛋白质结构中的氨基酸残基进行分析，选取可能影响其催化活性的26个氨基酸残基进行丙氨酸扫描突变、定点突变和组合突变，获得最佳突变体UGT94E13-F169G/I185G，其催化活性为野生型的13.90倍，kcat/Km值从1.97mM-1min-1提升至24.37mM-1min-1。对UGT94E13-F169G/I185G-尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)-RebD进行分子对接和分子动力学模拟，对突变体催化活性提升的机制进行了解析。在UGT94E13-F169G/I185G中，催化残基H13的?位氮原子与RebD的糖基D的C-6位羟基氢原子之间的距离以及UDPG的C1P与RebD的糖基D的C-6位羟基氧原子之间的距离，相较于UGT94E13均明显缩短，更有利于RebD糖基的C-6位羟基去质子化，因而具有更高的酶催化活性。 3.构建糖基转移酶-蔗糖合酶级联反应体系实现了RebM2和RebM8的高效制备，并对其味觉特性及生物活性进行了研究 为获得大量的RebM2和RebM8用于性质研究，构建了糖基转移酶-蔗糖合酶级联反应体系。利用蔗糖合酶AtSuSy实现糖基供体UDPG的循环再生，降低了生产成本。鉴于最佳突变体UGT94D1-F119I/D188的表达量较低，以纯酶方式构建了UGT94D1-F119I/D188-AtSuSy级联反应体系。通过分批补料的策略进行RebM2的2mL反应体系制备，反应8h后，以92%的产率，成功合成了29.79g/L的RebM2。而对于最佳突变体UGT94E13-F169G/I185G，则与AtSuSy在大肠杆菌表达菌株中共表达，利用细胞裂解液进行了RebM8的25mL反应体系制备。反应10h后，以98%的产率实现了31.64g/LRebM8的生物合成。随后，利用电子舌对RebM2和RebM8的甜味进行研究。相较于RebD，RebM2和RebM8的甜味均有提升，证明了在RebD的C-19位和C-13位引入β-1,6-O-糖苷键对其甜味性质改善的重要性。最后，对RebM2和RebM8的抗炎和降脂活性进行了研究。RebM2和RebM8在降低ROS释放量、抑制肿瘤坏死因子、抑制3T3-L1前脂肪细胞分化及降低甘油三酯(TG)含量等方面均优于RebD，进一步证实了糖基化修饰对甜菊糖苷生物活性的促进作用。
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