摘要
3-岩藻糖基乳糖(3-fucosyllactose，3-FL)是一种岩藻糖基化的人乳寡糖（Humanmilkoligosaccharides，HMOs），对于婴幼儿免疫系统的发育和肠道屏障的增强具有重要作用，在医药、食品等行业具有广阔的市场前景。微生物发酵法因具有绿色安全、成本低，易于规模化等优势，已成为制备3-FL的主要方法。本研究选择野生大肠杆菌MG1655（EscherichiacoliMG1655）作为出发菌株，通过引入外源α-1,3-岩藻糖基转移酶构建3-FL从头合成途径，进一步结合优化关键酶的表达、增加前体供应、途径酶的共定位，以及辅因子工程等组合策略，获得能够高效生产3-FL的大肠杆菌细胞工厂。 （1）优化α-1,3-岩藻糖基转移酶的表达。在E.coliMG1655中，使用Ptac启动子，多位点整合表达拟杆菌（Bacteroidesgallinaceum）来源的α-1,3-岩藻糖基转移酶的编码基因futM2，菌株3-FL产量为0.13g·L-1；进一步筛选促溶标签以增加胞内α-1,3-岩藻糖基转移酶的可溶性表达，发现SUMO标签的促溶效果最为显著，基因组整合表达融合了sumo标签的futM2后，重组菌株E6的3-FL的产量达到0.31g·L-1。 （2）提高前体乳糖和GDP-L-岩藻糖的供给以增强3-FL的合成。通过敲除编码葡萄糖特异性转运膜透性酶EⅡBCGlc的基因ptsG解除碳源阻遏效应（carboncataboliterepression，CCR）对乳糖转运的抑制，敲除分解乳糖的编码β-乳糖苷水解酶的基因lacZ和编码乳糖阻遏蛋白基因lacI以提高乳糖的转化率，强化乳糖渗透酶LacY的表达以增加细胞对乳糖的转运能力，获得的菌株3-FL的产量达到2.5g·L-1，转化率为0.31mol·mol-1乳糖；进一步将3-FL合成竞争途径的关键基因wcaJ、pfkA、nudD进行敲除，菌株3-FL产量提高至4.2g·L-1；在此基础上，通过敲除蛋白酶基因lon，并过表达正调控因子RcsA以增强合成GDP-L-岩藻糖途径酶的表达水平，菌株3-FL产量提升至5.2g·L-1，转化率为0.36mol·mol-1乳糖。 （3）基于无膜细胞器的途径酶共定位促进菌株3-FL的合成。基于无序蛋白FUSN（ALS相关RNA结合蛋白的N端无序蛋白序列）和RGG（P颗粒蛋白LAF-1的富含精氨酸和甘氨酸的结构域），以及互作短肽对RIAD-RIDD，构建了无膜细胞器系统；通过在3-FL合成途径酶的N端融合短肽RIAD，使用N端含有短肽RIDD的无序蛋白对3-FL合成途径酶进行招募，结果显示，利用无膜细胞器对途径酶ManB和ManC进行组装后，菌株3-FL的产量明显提高，达到7.3g·L-1，为对照菌株的1.54倍。 （4）利用辅因子工程以增强3-FL的合成。在上述获取的重组菌株基因组中过表达与NADPH和GTP合成相关的基因zwf、gnd、icd、gsk、pntAB和udhA，结果发现，过表达zwf对菌株3-FL产量的提升效果最明显，摇瓶水平的产量达到了8.2g·L-1，3L发酵罐补料分批发酵后3-FL产量为10.8g·L-1。
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