摘要
载体化技术是在加工、贮藏及胃肠道中保护益生菌的有效策略。作为益生菌主要产品形式，冷冻干燥载体化菌粉已经实现优异的冷冻干燥存活和贮藏稳定性，而胃肠道耐受性有限，且市售菌粉普遍采用的多层包埋技术增加了制备复杂性。基于酸不溶碱溶的pH响应性，海藻酸钙已被证明是在胃肠道中保护益生菌的理想壁材，然而存在干燥过程中存活损失的挑战，一直未被关注。因此，本论文拟在明确海藻酸钙载体化益生菌冷冻干燥存活损失机制的基础上，提出针对性的解决策略，实现益生菌从干燥至胃肠道全程稳态化。主要研究内容和结果如下： 1.海藻酸钙载体化益生菌冷冻干燥存活特性及其损伤机制：与海藻酸钠相比，海藻酸钙载体化鼠李糖乳杆菌GG（LactobacillusrhamnosusGG，LGG）冷冻干燥存活低。该失活主要发生在干燥阶段，与海藻酸钙中钙离子浓度的增加呈正相关，其终浓度等同于2.0–2.5mol/L的CaCl2。钙离子溶液模型测试表明CaCl2浓度大于1.5mol/L时LGG存活显著下降，而相同离子强度下Na+、Mg2+和K+溶液LGG存活的比较证实益生菌的钙离子损伤具有特异性。胞外碱性磷酸酶活性测试结果表明钙离子破坏了细胞壁完整性；BBcellProbe?T11荧光探针测试结果表明钙离子破坏了细胞膜完整性；人工电子受体测试结果表明钙离子抑制了代谢活性；BBcellProbe?F03荧光探针测试结果表明钙离子降低了胞内钙离子浓度，以上是LGG失活的因素。采用转录组学和非靶向代谢组学进一步分析钙离子对LGG的损伤机制：机制之一是钙离子通过下调甘油磷脂代谢通路中的glpO、上调LGG-RS07795和cls基因增加心磷脂，增加细胞膜的流动性，从而引起细胞膜分解代谢；其它机制可能是具有上下游关系的差异基因/差异代谢物共富集通路紊乱。 2.改善海藻酸钙载体化益生菌冷冻干燥存活策略及原位再培养生物膜状态益生菌：基于钙离子对细胞膜损伤机制，提出在海藻酸钙中复配小分子糖/糖醇以稳定细胞膜，结果表明冷冻干燥存活损失由1.10logCFU显著降至0.10–0.49logCFU。基于钙离子对差异基因/差异代谢物共富集通路紊乱机制，提出在海藻酸钙中复配共富集通路的低表达量差异代谢物以减缓通路紊乱，结果表明麦角硫因和胞苷分别将冷冻干燥存活损失显著降至0.73logCFU和0.33logCFU。为同时减缓细胞膜损伤和共富集通路紊乱，从形成物理阻隔以避免钙离子和益生菌接触的角度提出在MRS中原位再培养海藻酸钙载体化益生菌以形成自分泌胞外聚合物益生菌群体（生物膜状态益生菌）的策略。结果显示：生物膜状态LGG的冷冻干燥存活损失显著下降至0.13logCFU，且LGG菌粉的胃肠道耐受性（存活损失2.74logCFU/g）优于其它策略（存活损失约6-7logCFU/g）和市售菌粉（存活损失约5-8logCFU/g）。工艺可行性分析表明，在10×10×0.5cm规模的冷冻干燥盘内，与传统冷冻干燥保护剂LGG菌液干燥相比，原位再培养LGG海藻酸钙凝胶的冷冻干燥时间减少约9h，每克含菌量、每盘含菌量以及贮藏稳定性不存在显著差异。原位再培养策略应用于十种国产菌株和复合菌株的测试结果证明了该策略的普适性和对多菌株的兼容性。通过扫描电子显微镜确定了生物膜状态益生菌的不同生长阶段，而成熟阶段的生物膜最能提高益生菌胃肠道耐受性。酸奶发酵前和发酵后添加原位再培养LGG菌粉均能有效解决酸奶中益生菌无胆盐耐受性的问题。 3.原位再培养策略对后生元的影响：上述研究明确了原位再培养策略的可行性，但生物膜状态益生菌的形成本质是基因/代谢物表达量的调控，对益生菌功能性的影响未知，而发挥功能性的机制是其代谢物（后生元），因此探究了原位再培养策略对后生元的影响。首先基于LGG的宣称生理活性开展抗氧化活性分析，结果表明原位再培养策略使后生元抗氧化性由0.63Trolox当量显著增加至0.98Trolox当量。采用有机酸靶向代谢组学和中/短链脂肪酸靶向代谢组学从有机酸后生元的角度分析，抗氧化性增强的主要原因是柠康酸、阿魏酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸、泛酸、5-羟甲基-2-呋喃甲酸和丙酸含量的增加。KEGG分析表明，柠康酸含量增加的机制是缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成、C5支链二元酸代谢、2-氧代羧酸代谢三个通路；泛酸含量增加的机制是泛酸和辅酶A生物合成、辅因子生物合成两个通路；丙酸含量增加的机制是丙酸代谢、烟酸和烟酰胺代谢、芳香族化合物的降解三个通路。基于文献分析，进一步探讨了这些活跃的有机酸代谢与生物膜的关系：在生物膜形成初期阶段，原位再培养策略可能使益生菌的有机酸代谢更活跃，促进形成保护自身的生物膜；活跃的有机酸代谢也可能趋向突破生物膜限制，当有机酸积累到生物膜形成的播散阶段，益生菌脱落。此外，基于LGG产生的5-甲氧基吲哚乙酸后生元作为保护氧化性肝损伤新机制的报道，测试了原位再培养策略对该后生元的影响，结果表明原位再培养策略未显著改变其含量。 4.非干燥式海藻酸钙基生物膜状态益生菌载体设计及贮藏研究：基于功能食品零食化的食品工业发展新趋势，益生菌产品不再局限于传统菌粉。受自然界中抗逆性的生物膜状态微生物均处于非干燥状态的启发，非干燥式原位再培养生物膜状态益生菌可能同样具有良好稳定性和耐受性。因此，探索了海藻酸钙基生物膜状态益生菌的非干燥式应用。基于原位再培养策略，设计了高/低初始菌浓度（107CFU和105CFU）的海藻酸钙实芯和液芯凝胶珠以形成生物膜状态LGG（1010–1011CFU）。激光共聚焦显微镜图像证实了生物膜状态LGG的形成，实芯凝胶珠呈现出圆形的LGG菌落且被胞外聚合物包裹，而液芯凝胶珠中的胞外聚合物分布在整个液芯内处于流体状态。广泛靶向代谢组学和贮藏测试结果表明，由于原位再培养凝胶珠引入贮藏溶液的代谢物对LGG的损伤效果大于促生长效果，LGG在生理盐水和0.1%蛋白胨水溶液中4℃下贮藏6周存活损失高达3–5logCFU。相同贮藏条件下，MRS中的高贮藏存活结果（存活损失＜0.5logCFU）启示贮藏溶液中含有益生菌所需营养成分（碳源和氮源等）可提高促生长效果，营养饮品（酸奶、纯奶、奶茶和果汁）中的贮藏存活结果验证了该启示。 5.非干燥式海藻酸钙基生物膜状态益生菌胃肠道耐受性研究：胃酸模拟消化测试结果表明原位再培养LGG凝胶珠的胃酸耐受性没有显著下降，转录组学和非靶向代谢组学测试结果表明其高胃酸耐受性机制是生物膜状态LGG对胃酸损害的丙酸代谢和苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成两条通路的保护。胞外蛋白含量测试结果表明高初始菌浓度组具有更多的胞外聚合物含量，跨膜扩散测试和比表面积测试结果表明原位再培养LGG液芯凝胶珠具有更低渗透性，呈现出更高的LGG胆盐耐受性。原位再培养LGG凝胶珠的胃肠道耐受性不受贮藏和益生元的影响。基于消费者口服时存在的咀嚼和吞咽行为，测试了破碎和尺寸对原位再培养LGG实芯凝胶珠胃肠道耐受性的影响，结果表明其对胃酸耐受性没有影响，降低了胆盐耐受性，而生物膜成熟阶段的优化是有效解决策略。原位再培养LGG液芯凝胶珠破裂后失去胆盐耐受性，原因是流动态的胞外聚合物随海藻酸钙膜的破裂而分散，从而无法有效保护菌体。酸奶发酵前和发酵后添加原位再培养LGG实芯凝胶珠均能有效解决酸奶中益生菌无胆盐耐受性的问题，而且未改变破碎对原位再培养LGG实芯凝胶珠胃肠道耐受性的影响。 综上，本论文明确了钙离子损伤机制是海藻酸钙载体化益生菌冷冻干燥存活损失的原因，而原位再培养形成生物膜状态益生菌是有效策略，实现了益生菌从干燥至胃肠道全程稳态化的目标，且优于目前商业化菌粉水平。此外，该策略能够增加后生元抗氧化性，阐明了其对益生菌功能性的积极影响。同时，海藻酸钙基生物膜状态益生菌可以实现非干燥式应用。
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