摘要
藻蓝素(Phycocyanobilin，PCB)是一种蓝色四吡咯化合物，天然存在于藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白中，由于具备抗氧化抗炎抗癌等功能，广泛应用于食品、药品和化妆品领域。目前，PCB主要通过甲醇分解法于70-80℃从螺旋藻中提取，然而，高温甲醇分解消耗大量能量，螺旋藻生长周期较长，限制了PCB的生产效率和应用。微生物法合成PCB具有低成本、低耗能、高纯度等优势，因此本研究以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主，来实现PCB的高效表达。首先，通过酶源筛选确定了ThermosynechococcusvestitusBP-1来源的血红素加氧酶(HO，Hemeoxygenase)和Synechocystissp.PCC6803来源的藻蓝素铁氧还蛋白还原酶(PcyA，Phycocyanobilin:ferredoxinoxidoreductase)为最适合PCB合成的关键酶。在此基础上对两种酶进行理性设计，开发了高通量筛选HO和PcyA突变体的方法，筛选出酶催化活力提高的突变株HOT(F29W/K166D)和PcyAS(D220G/H74M)。最后，通过DNA支架组装HOT(F29W/K166D)和PcyAS(D220G/H74M)和过量表达前体血红素合成关键酶，在5L发酵罐水平获得了PCB的最高产量。主要内容及结论如下： (1)为确定最佳来源的HO和PcyA，本研究表达了10种不同动物、植物、微生物来源的HO和5种不同藻类来源的PcyA，筛选出最适合PCB合成的关键限速酶，ThermosynechococcusvestitusBP-1来源的HO和Synechocystissp.PCC6803来源的PcyA在大肠杆菌BL21(DE3)中催化效果最好，中间体胆绿素(Biliverdin，BV)和PCB产量分别达到5.62mg·L-1和10.60mg·L-1。 (2)为提高样品检测效率，利用红外荧光蛋白iRFP和Alr1966g2C56A可分别与BV和PCB特异性结合的特性，建立了高通量筛选HO和PcyA的方法，在特定波长下荧光值与发色团(BV/PCB)浓度呈线性相关，不受前体物质干扰，缩短了检测时间，有利于筛选HO和PcyA突变体以及发酵生产BV和PCB样品的快速定量。 (3)为了进一步提高HO和PcyA催化活性，分别对ThermosynechococcusvestitusBP-1来源的HO和血红素、Synechocystissp.PCC6803来源的PcyA和BV进行分子对接和虚拟饱和突变,经过多轮突变，筛选出BV/PCB产量提高最佳双突变株HOT(F29W/K166D)和PcyAS(D220G/H74M)，BV和PCB产量分别达到13.41mg·L-1和18.47mg·L-1。 (4)为减少HO和PcyA催化时的空间隔离障碍，采用DNA支架组装HOT(F29W/K166D)和PcyAS(D220G/H74M)，为增强前体血红素内源合成，适度过表达血红素合成途径关键酶PBGS和FECH，PCB产量达30.18mg·L-1。最后，在摇瓶水平优化发酵条件，确定了30℃的诱导温度和GMD培养基，在5L发酵罐中进行补料分批发酵，PCB产量达184.20mg·L-1，这是迄今为止报道的微生物合成PCB的最高产量。
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