摘要
对羟基苯甲酸（para-hydroxybenzoicacid,PHBA）是重要的芳香族化合物，广泛应用于聚酯等高分子材料的生产，并在抗菌药物中发挥重要作用。与依赖于石油的化学合成法相比，微生物发酵法为PHBA的生产提供了一种绿色可持续的生产方法。然而，复杂的胞内代谢通量分布和产物毒性限制了微生物生产PHBA的能力。本研究基于化学计量分析，选择了一株实验室保藏的高产苯丙氨酸的大肠杆菌（Escherichiacoli）作为生产PHBA的底盘菌株，并通过启动子工程、模块化工程等系统代谢工程策略提高了PHBA的产量。此外，通过构建并应用加速适应性进化系统，显著提高了菌株的耐受和生产能力。最后，通过优化发酵条件，实现了PHBA的高效生产。主要研究结果如下： (1)基于化学计量分析筛选底盘菌株：首先，通过化学计量分析微生物合成PHBA的代谢途径，选择PEP/E4P需求比例与PHBA合成相同的芳香族氨基酸生产菌株，作为生产PHBA的备选底盘菌株。其次，通过阻断下游途径，过表达EcubiC强化PHBA的合成，成功构建生产PHBA的底盘菌株。摇瓶测试表明，苯丙氨酸高产菌株最适合作为底盘菌株，PHBA产量达到0.68g·L-1。 (2)系统代谢工程改造促进PHBA生产：首先，基于关键节点将整个合成路径划分为三个模块，并通过引入aroGS180F、ppsA和tktA，敲除poxB和ldhA，提高了DAHP的供应。其次，通过启动子工程，优化了模块二中关键酶aroB和aroE的表达水平，实现了碳代谢流富集。进一步地，通过体外级联确定了模块三中的关键酶AroA和AroC，并在体内实现了代谢重构，得到的工程菌株E.coliPHBA05的PHBA产量达到3.97g·L-1，但质粒负担导致的生长抑制使菌株的最大OD610仅为25.1。最后，通过拷贝数优化、RBS工程和重复表达策略优化模块间的代谢流，得到的工程菌株E.coliPHBA07在摇瓶中的PHBA产量为6.35g·L-1，在5L发酵罐水平的PHBA产量、得率和生产强度分别为14.17g·L-1、0.15g·g-1和0.30g·L-1·h-1。 (3)适应性进化提高耐受和生产能力：首先，基于文献调研，设计由突变模块和传感模块构成的加速适应性进化系统。其次，借助不同的抗生素对突变模块的诱变效率、突变位点及突变谱系等进行探究，确定了最优突变模块Mutator2。此外，研究了传感模块PyhcN-mKate2对PHBA浓度的响应。最后，将进化系统应用于工程菌株E.coliPHBA07，进化终点的PHBA浓度为7.75g·L-1，比对照株提高了35%；得到的最优突变株的摇瓶产量为8.12g·L-1，比E.coliPHBA07提高了28%，IC50为6.59g·L-1，比E.coliPHBA07提高了47%。 (4)发酵优化实现PHBA高效生产：为了进一步释放菌株的生产潜力，提高PHBA产量和得率，对发酵过程中的pH和诱导OD进行了优化。当pH维持在6.9，OD为19时进行诱导，对PHBA的生产最为有利。在最优发酵条件下，对补糖速率进行精细调控，E.coliPHBA09的PHBA产量、得率和生产强度分别达到21.35g·L-1、0.19g·g-1和0.44g·L-1·h-1。
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