摘要
草鱼是我国淡水养殖业的重要品种，草鱼呼肠孤病毒（grasscarpreovirus,GCRV)是一种危害性极强的病毒，由它引发的病毒性草鱼出血病（grasscarphemorrhagicdisease,GCHD)对鱼种阶段的草鱼产生了极大的威胁，可使其死亡率达到90%以上，在池塘养殖中一旦爆发该种疾病，其后果往往是灾难性的。先前的研究表明，GCRV实验性感染后，病毒可在宿主体内的多个器官和组织中分布并造成病理损伤，但我们对自然状态下急性感染草鱼的病毒组织分布却知之甚少，同时GCRV的流行具有典型的季节性，提示该病毒可建立潜伏感染，但GCRV的潜伏感染和潜伏感染的靶器官尚未得到验证，也未见GCRV潜伏感染再激活相关的研究。本研究鉴定了GCRV-II急性感染和潜伏感染这两种感染模式下的草鱼，对这两种感染模式下草鱼的病毒组织分布和病理变化进行了研究，确定了GCRV-II潜伏感染的靶器官，同时通过实验性感染的方式，验证了温度能够调控GCRV-II潜伏状态和激活状态的相互转变。主要研究内容如下： 1.GCRV-II急性感染和实验性感染草鱼的临床症状不同 通过GCRV-II人工腹腔注射感染，我们得到了具有典型草鱼出血病症状的草鱼，将其与急性感染草鱼的症状进行对比，发现前者的肌肉块状充血，呈淡红色，解剖后有少量腹水，肠道无明显症状，而急性感染草鱼的全身肌肉充血红肿，呈深红色，解剖后有大量腹水，肠道充血红肿。因此GCRV-II实验性感染能够复刻急性感染草鱼的症状，但整体来说症状相对较轻。 2.GCRV-II急性感染和潜伏感染草鱼的病毒组织分布 以SqRT-PCR和Westernblot分析GCRV-II急性感染和潜伏感染后病毒的组织分布，结果显示急性感染时，脑、心脏和眼睛的病毒载量较高，其他组织包括鳃、中肾、脾脏、肝胰脏、肠道、鳔、骨骼肌、尾鳍、皮肤、外周血中也能检测到载量较低的病毒。然而潜伏感染样品中只有脑组织能检测到病毒。比较两种感染模式下脑组织的病毒载量发现潜伏感染的病毒载量低于急性感染。以健康草鱼的脑组织作为阴性对照，间接免疫荧光显示两种感染模式下的草鱼脑 组织均为GCRV-II阳性，同时透射电镜结果显示两种不同感染模式下的草鱼脑细胞的细胞质中均能观察到病毒粒子，既有散在分布的也有致密的病毒包涵体(VIBs)结构。因此脑、心脏和眼睛是GCRV-II急性感染时的主要入侵部位，而脑是GCRV-II潜伏感染的靶器官。 3.GCRV-II急性感染和潜伏感染的组织和细胞病理变化 本研究中，我们观察了GCRV-II急性感染草鱼的脑、心脏和眼睛这三个器官的临床症状，发现心脏和眼睛都有不同类型的病理症状，而脑与健康草鱼脑无异。以健康草鱼为对照，观察比较急性感染和潜伏感染草鱼的脑、心脏和眼睛的组织病理切片，发现GCRV-II急性感染的草鱼三个器官中均出现不同程度的病理变化，而潜伏感染的草鱼只有脑中观察到了病理变化而且这种变化对比急性感染更轻微。透射电镜观察发现，潜伏感染的草鱼脑细胞中存在胞质空泡的病理变化，在急性感染中除了胞质空泡外，还存在内质网排列紊乱和核膜消失的病理变化。因此，GCRV-II急性感染时能对草鱼的心脏、眼睛和脑造成组织结构的破坏，并在心脏和眼睛的外观体现出症状，而潜伏感染时只有脑组织能观察到病理变化，同时在透射电镜下，两种感染模式的脑细胞都能观察到病理变化。 4.温度调控GCRV-II潜伏感染的建立或再激活 第一个部分以荧光定量PCR分析在28℃、24℃、18℃、12℃和4℃五个不同温度梯度下GCRV-II实验性感染后病毒的组织分布。在病毒增殖最快的28℃下，鳃、中肾、脾脏、头肾、脑、肝胰脏、肠道、鳔、心脏、眼睛、骨骼肌、尾鳍、皮肤和血液中均有病毒分布，其中脑的病毒载量远远高于其他组织，心脏和眼睛紧随其后，这种趋势一直延续到12℃下，但在这个降温过程中所有组织的病毒载量均有不同程度的收缩和降低。当温度降低到4℃时，所有组织中只有脑能检测到病毒，提示病毒进入潜伏状态。 第二部分将饲养潜伏感染草鱼的鱼缸逐渐升温至28℃，通过RT-PCR验证病毒是否能够重新激活。在这个过程中损失了2尾草鱼，存活的6尾草鱼中有2尾草鱼未检测到病毒，3尾草鱼仍处于GCRV-II潜伏感染状态，只有1尾草鱼成功激活。通过这两个部分的实验再一次验证了脑是GCRV-II的潜伏部位，同时发现了GCRV-II潜伏状态和激活状态的相互转变是受到温度调控的。 本研究系统的比较了CGRV-II急性感染和潜伏感染草鱼的病理变化和病毒组织嗜性，得出在急性感染时，脑、心脏和眼睛是病毒的主要入侵位点，而脑则是病毒潜伏感染的靶器官。此外，本研究通过实验性感染建立了病毒潜伏感染和再激活的实验模型，发现GCRV-II潜伏感染和激活状态的相互转变受到温度调控。
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