摘要
L-高丝氨酸(L-Homoserine,L-Hom)是一种重要的氨基酸,可作为前体合成许多高附加值产品.本研究以实验室前期构建的一株L-高丝氨酸生产菌株—大肠杆菌EscherichiacoliHOM1为出发菌株,采用编程代谢路径与调节细胞分裂C+D期相结合的策略进行一系列理性代谢改造,构建了一株无质粒且无需诱导的高产L-高丝氨酸的工程菌株.主要研究结果如下: (1)阻断有机酸分支代谢与L-高丝氨酸降解途径促进L-高丝氨酸积累.为阻止糖酵解副产物的产生以重新分配碳通量,分别敲除出发菌株HOM1的有机酸支路关键基因ldhA、pflB和adhE,但L-高丝氨酸的产量并没有提高.随后为节约碳流,分别敲除HOM1的L-高丝氨酸降解基因thrB、lysA和metA.其中HOM5(HOM1,ΔthrB)的L-高丝氨酸产量达到50.15g·L-1,相比HOM1提高21.63%. (2)修饰磷酸转移酶系统尝试增强PEP(磷酸烯醇式丙酮酸)供给强化L-高丝氨酸合成.敲除HOM5编码葡萄糖磷酸转移酶ⅡBC的ptsG基因后菌株出现严重的生长障碍,因此引入来自运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)的编码葡萄糖转运蛋白的glf基因并增加编码葡萄糖激酶的glk基因的拷贝以加强葡萄糖的转运及磷酸化,随后对两个基因的合适表达强度进行考察.然而工程菌的L-高丝氨酸产量没有达到HOM5的水平,说明修饰磷酸转移酶系统以促进L-高丝氨酸积累的策略不适合HOM5菌株,需使用合适策略增强其他前体的供给. (3)重构PEP(磷酸烯醇式丙酮酸)-PYR(丙酮酸)-OAA(草酰乙酸)节点加强合成L-高丝氨酸的碳通量.在HOM5中引入另一个ppc的拷贝获得HOM13(HOM5,yjiT::Ptrc-ppc),其L-高丝氨酸产量升至52.7g·L-1,并继续引入谷氨酸棒杆菌来源的pycP458Scgl以加强草酰乙酸的合成,HOM14(HOM13,ynck::Ptrc-pyccglP458S)的L-高丝氨酸产量与HOM5相比增加8.18%,升至54.25g·L-1.随后,尝试分别敲除HOM14的乙醛酸循环抑制因子iclR和arcA以加速乙醛酸循环加强草酰乙酸的供给,但未见其对L-高丝氨酸积累的促进作用. (4)引入自我调节启动子协调细胞生长与L-高丝氨酸合成.通过考察细胞分裂C+D期与L-高丝氨酸合成的关系,发现C+D期缩短的菌株HOM18(HOM14,fliK::Ptrc-nrdAB,ompT::Ptrc-ftsZA)较HOM14显示出更高的L-高丝氨酸产量与生物量,但L-高丝氨酸的合成速率随细胞增长而放缓.随后通过引入自我调节启动子在指数后期和稳定期协调细胞生长并获得更高的L-高丝氨酸产量(62.49g·L-1). (5)5L生物反应器补料分批发酵L-高丝氨酸.在5L生物反应器中进行补料分批发酵.最终的工程菌HOM23(HOM14,fliK::PfliC-nrdAB,ompT::PfliC-ftsZA)发酵53h,L-高丝氨酸的产量为101.31g·L-1,生产强度达到1.91g·L-1·h-1,相比出发菌株分别提高18.78%和7.3%,为目前已报道无质粒菌株中L-高丝氨酸的最高产量及生产强度.
NETL