摘要
两性分化对于雌雄异株植物的物种演化和植物生物多样性的维持至关重要，但其内在分子机制仍然鲜为人知。桑依靠风媒传粉、开单性花，雌雄异株或同株，且在花的结构、数量、开花时间等特征表现出明显的性别特征。目前，桑全基因组已完成组装，且同属植物中包含许多雌雄异株和同株的物种，通过比较转录组分析及适应性进化分析，筛选出雌雄异株植物中与性别二型相关的表达基因，从而揭示自然选择对桑树性别分化和适应的驱动作用。本研究分别收集白桑四个品系——开雌花的育20号、雄或雌雄同株白条桑、雌雄同株育81号、开雄花的育2号的花序材料，通过转录组测序比较，筛选出雌雄花差异表达基因，利用RT-qPCR技术分析雌雄差异表达基因在花不同发育时期及不同组织的表达特征，并对性别偏向表达基因进行选择压力分析，探索与桑树性别分化与适应的相关的分子足迹。最后，利用VIGS技术沉默挖掘出的正选择性别表达差异基因MaBEE1和MaVAP22，探索其在桑树性别分化中的功能，为揭示桑树雌雄异株的进化途径提供理论依据。主要研究结果如下： 一、桑树雌雄偏向表达基因的鉴定 桑树雌花、雄花转录组测序共获得18486个转录本。其中，雌雄偏向表达基因1543个：841个在雄花序中显著上调表达，702个在雌花序中显著上调表达。此外，在雄花中特异表达的基因为333个；在雌花中特异表达基因为33个。雌雄偏向表达基因比例接近于1:1，雌雄特异表达基因比例为10:1。KEGG通路富集结果表明，雌性偏向表达基因主要注释在植物激素信号传导、植物与病原体互作等途径，而雄性偏向表达基因主要富集在苯丙类化合物的合成，以及丙酮酸代谢等途径上。推测桑树性别二型与基因的性别偏向表达有关，且基因的偏向表达可能是桑树雌雄有差别的繁殖贡献决定的。SNP位点多态性分析检索到6193条序列包含20403个SNP位点。783个存在性别偏向表达的基因包含3198个SNP，其中雄性偏向表达基因492个，含SNP的雌性偏向表达基因仅为291个，占雄性偏向表达基因的59.1%。说明雄性偏向表达基因可能具有更高的序列变异。 二、桑树性别偏向表达基因时空、组织表达谱及序列进化分析 利用RT-qPCR技术对10个与开花调控相关的雌雄差异表达基因进行时空及组织表达谱分析。结果表明：调控胚珠发育的基因AGL11，参与调控雄蕊发育的PMADS2基因，表达水平在生长期最大，成熟期有所下降；ARF、AP2-like与油菜素甾醇响应因子BEE1基因表达水平在花芽期最大；PP2C和IAA4基因则在生长期表达量最大，IBS1基因在花芽期、成熟期表达水平较高。VAP2基因在成熟期表达量下降。以上基因在花的不同发育时期相对表达量存在较大差异，推测这些基因可能参与了不同花器官发育的调控过程。在组织水平上，除PP2C、IAA4基因在叶中的表达水平略高于花以外。其余几个基因均在花器官表达量最大。表明桑的性别二型主要体现在花而不是其他组织器官上。10个基因序列进化分析检测到5个正选择基因，包含4个雌性偏向表达基因和1个雄性偏向表达基因，分别是调控生长素合成并与ARF转录因子作用拮抗的IAA4转录因子、调控花器官形态建成的AP2-like转录因子、调控短日照条件开花的BEE1转录因子和BABA抗性诱导相关的IBS1基因。表明在开花调控及花形态建成方面，雌性偏向表达基因比雄性偏向表达基因具有更高的序列进化，雌株可能承受更强的选择压力。 三、桑树性别偏向表达基因适应性进化分析 选取与白桑亲缘关系较近的川桑作为比较类群，将同属蔷薇目的桃、大麻作为外类群，开展序列水平的比较转录组学分析，共获得102组直系同源基因，通过选择压力分析，在白桑、川桑、大麻、桃中共筛选出139个正选择基因和719个正选择基因位点。与白桑性别偏向基因比较后，筛选出18个受正选择的性别偏向表达基因，其中，雌性偏向表达基因5个，雄性偏向表达基因13个，包含显著雌性偏向表达的STI、BEE1基因和显著雄性偏向表达的ANK、VAP2基因。正选择基因富集分析结果表明：雌性偏向表达基因存在与植物生长发育调节相关的适应性进化，雄性偏向表达基因则存在次级代谢产物合成相关的适应性进化。推测在基因表达水平和序列水平同时检测到正选择信号的基因，可能参与桑树性别二型的形成，并最终导致雌雄异株分化。 四、利用桑树VIGS技术探究MaBEE1/MaVAP22基因功能 克隆获得受正选择的雌、雄偏向表达基因MaBEE1和MaVAP22的完整CDS序列，全长分别为900bp和834bp，编码299和416个氨基酸。MaBEE1基因编码蛋白包含bHLH结构域，而MaVAP22基因编码蛋白包含Motile_Sperm超家族结构域，两个蛋白均属于不稳定蛋白。RT-qPCR分析表明，MaBEE1和MaVAP22基因分别在雌花和雄花上有更高的表达水平（plt;0.05）。利用VIGS技术成功构建MaBEE1和MaVAP22基因沉默载体，通过检测基因沉默后，生理生化指标的变化对基因的功能进行预测。结果显示，MaVAP22表达水平下调后，MDA含量升高，抗氧化酶活性下降，除可溶性糖以外的其他渗透调节物含量下降。而MaBEE1基因表达水平的下调后，则只有POD的含量显著下降，其他指标均无明显变化。推测雌性偏向表达基因MaBEE1可能在过氧化物酶的合成中起调节作用，促进了生长素的氧化，从而在促进植物生长发育过程中发挥作用。而雄性偏向表达基因MaVAP22可能参与植物抗逆性调控的相关过程。 本研究通过对白桑雌雄花序进行比较转录组分析，筛选出性别差异表达基因，对差异基因进行功能富集，分析其时空、组织表达特性，并对差异基因进行选择压力分析，以探索桑树性别分化的机理，揭示性别进化的动力；构建了桑树性别分化的候选基因VIGS转化体系，对候选基因的功能进行初步探索。研究结果将有助于阐明桑树性别分化的起源，并为性别分化维持机制的研究提供理论依据。
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