摘要
麦角硫因（Ergothioneine，ERG）是一种高价值的天然氨基酸，由于其强大的抗氧化性、抗衰老、抗辐射以及预防各种疾病等多种作用，因此广泛应用于保健品、化妆品、药品等领域。目前ERG的制备有多种方法，其中植物提取法和化学合成法存在诸多问题，如成本高、工艺复杂、安全性差等。而微生物合成法通过构建高产ERG菌株并进行发酵生产，能克服上述缺陷实现ERG的高效合成。 为增强ERG的微生物合成，本研究分别采用两种重要工业宿主-大肠杆菌（Escherichiacoli）BL21(DE3)和巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）GS115，在E.coli中结合新的菌株改造策略如细胞外膜结构，而P.pastoris则是首次用于异源合成ERG，最后比较两种不同的表达系统合成ERG的差异。主要研究内容和结果如下： （1）在P.pastoris中合成ERG。分别采用P.pastorisGS115，以及细胞壁葡聚糖精简菌株H001（GS115ΔPAS_chr1-3_0225）和H002（GS115ΔPAS_chr1-3_0661）作为出发菌株，组合粗糙脉胞菌（Neurosporacrassa）来源的ERG合成基因egt1、egt2以及耻垢分枝杆菌（Mycobacteriumsmegmatis）来源的ERG合成基因egtE，构建两条合成途径egt12和egt1E，利用表达载体pPICZA(PAOX)和pGAPZA(PGAP)，组合获得12种ERG生产菌株。结果显示：无论采用哪种启动子和宿主，egt1E转化子的ERG产率均优于egt12转化子；无论何种出发菌株和基因组合，PGAP优于PAOX；较之GS115，H001和H002更利于ERG的合成。其中ERG最高产菌株为H001-PGAP-egt1E，产量达75.85±1.41mg?L-1，比GS115-PGAP-egt12提高了83.17%。 （2）在E.coli中构建并优化ERG的合成。策略依次为：1）在BL21(DE3)中表达M.smegmatis来源的ERG合成基因簇egtBCDE，ERG产量达57.38±2.09mg?L-1；2）分别过表达N.crassa来源的基因egt1，以及E.coli中GshA的异构体egtA，ERG产量提高至63.31±2.92mg?L-1和72.67±1.50mg?L-1。二者共同表达时ERG产量提高至82.97±1.25mg?L-1；3）针对前体氨基酸合成途径进行优化，过表达关键酶：ATP磷酸核糖基转移酶HisG、腺苷甲硫氨酸合酶MetKI303V和D-3-磷酸甘油酸脱氢酶SerAT410stop，ERG产量提高至86.83±1.72mg?L-1、95.01±1.33mg?L-1和97.85±2.39mg?L-1，将MetKI303V和SerAT410stop共同表达，ERG产量提高至109.10±1.65mg?L-1。4）敲除前体氨基酸合成途径上的主要抑制基因，分别敲除转录抑制蛋白PurR、色氨酸酶TnaA和L-半胱氨酸脱硫酶YhaM，ERG产量提高至113.39±2.08mg?L-1、124.45±2.01mg?L-1和127.24±1.91mg?L-1。同时敲除TnaA和YhaM，ERG产量提高至137.77±2.62mg?L-1；5）针对细胞外膜脂多糖结构进行改造，敲除庚糖基转移酶WaaF后细胞外膜的渗透性提高，ERG产量进一步提高至146.56±2.23mg?L-1。 （3）两种不同的微生物表达系统比较：1）发酵特性及产率不同：P.pastoris改造菌株（GS115ΔPAS_chr1-3_0225-pGAPZA-egt1E）的ERG体积产率更高，在2L生物反应器中发酵144h获得ERG产量415.36±12.97mg?L-1；E.coli改造菌株（BL21ΔtnaAΔyhaMΔwaaF-pCDF-egtBCDE/pRSF-egt1A-metKI303V-serAT410stop）的ERG时间产率更高，培养96h后达到3.49±0.18mg?L-1?h-1。2）细胞膜壁精简均能提高产率：在P.pastoris和E.coli中，都进行了细胞膜壁结构的相关改造，对于ERG的合成产量都有一定提升。 本研究利用两种重要菌株开展ERG的合成优化，将为工业水平制备ERG宿主选择及菌株改造提供重要参考。
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