摘要
脱发是一种由遗传性因素、自身免疫疾病、社会压力和营养失调等引起的毛发再生障碍，已成为当今社会普遍的健康问题。毛囊是毛发生长的基础结构，其生长发育过程分为生长期、退行期和休止期。脱发的主要特征是毛囊小型化（或毛囊萎缩）和生长期缩短，所以防脱的关键是刺激毛囊细胞生长和调节毛囊生长周期。侧柏叶是中医药治疗脱发的常用药物，同时也是保健食品原料。药理学研究发现侧柏叶通过Akt/GSK3β/β-catenin信号通路促进小鼠的毛发生长，其活性成分大多为黄酮类化合物。但侧柏叶中的黄酮类多以糖苷的形式存在，生物利用率低，生产应用存在一定的局限性。微生物发酵能够对中药中的活性成分进行有益转化，使药物的治疗效果得到增强。基于上述背景，本课题旨在筛选能够协同侧柏叶增强护发防脱功效的乳杆菌，并通过动物实验对侧柏叶协同乳杆菌的促生发功效和调控机制进行解析，最后探究功效提升的物质基础。主要研究内容和结果如下： （1）筛选与侧柏叶协同增效的潜在功能菌株。以50g/L侧柏叶提取物和10g/L酵母粉制备发酵培养基，选取45株乳杆菌发酵18h，分别使用发酵前后的上清液干预人毛囊真皮乳头细胞（Humandermalpapillacells，HDPCs），测定HDPCs细胞活力和对Wnt/β-catenin信号通路、相关生长因子和细胞凋亡通路的影响，最终得到6株发酵后可显著促进HDPCs增殖和多靶点调控毛囊生长发育的乳杆菌，包括2株副干酪乳酪杆菌（CCFM1349、CCFM1350）和4株植物乳植杆菌（CCFM1348、CCFM1351、CCFM1352、CCFM1353）。 （2）通过C57BL/6小鼠脱发模型研究侧柏叶协同乳杆菌对毛发再生的影响。连续21d分别向小鼠灌胃侧柏叶提取物（CPE组）、6株乳杆菌灭活后的MRS培养代谢产物（灭活组）、发酵侧柏叶代谢产物（发酵组）、活菌（活菌组）以及活菌与侧柏叶提取物制备的合生制剂（合生制剂组）。观察小鼠背部皮肤颜色和毛发生长状态探究体内的促生发能力。结果显示，6株乳杆菌的发酵组及合生制剂组均可显著促进小鼠的毛发生长。其中，干预14d时，植物乳植杆菌（CCFM1348、CCFM1351、CCFM1353）和副干酪乳酪杆菌CCFM1349发酵组比其灭活组和CPE组有着更好的促生发效果。与侧柏叶提取物相比，毛发覆盖率分别提高了14.53、8.81、3.68和12.94%。植物乳植杆菌（CCFM1348、CCFM1353）合生制剂比其对应的活菌组和CPE组有着更好的促生发效果，毛发覆盖率高达79.72%和76.87%。 （3）通过检测Wnt/β-catenin通路（β-catenin、Wnt5a、Wnt10b、LEF1）、抑毛发生长因子，例如转化生长因子β（Transforminggrowthfactor，TGF-β）、细胞凋亡通路（Ki67、BAX、Bcl2）和促毛发生长因子，例如血管生成生长因子（Vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）和胰岛素样生长因子（Insulin-likegrowthfactor1，IGF-1）的表达，探究干预物促进毛发再生的调控机制。结果显示，与对应菌株灭活组和CPE组比较，CCFM1348发酵组可显著提高VEGF表达，下调TGF-β2表达和BAX表达。CCFM1349发酵组可显著提高Bcl2表达，下调TGF-β2表达。CCFM1351发酵组可显著提高Ki67表达。CCFM1353发酵组可显著提高β-catenin表达、Wnt10b表达和Ki67表达，下调TGF-β2表达和BAX表达。与对应菌株活菌组和CPE组比较，CCFM1348合生制剂组可显著上调LEF1表达、VEGF表达、IGF-1表达、Bcl2表达和Ki67表达，显著降低TGF-β1表达和BAX表达。CCFM1353合生制剂组可显著上调β-catenin表达、IGF-1表达和Ki67表达。因此，侧柏叶协同乳杆菌调控毛发生长的机制可能是代谢产生的物质激活Wnt/β-catenin信号通路，调控生长因子表达以及抵抗细胞凋亡。 （4）通过非靶代谢组学分析植物乳植杆菌CCFM1348代谢侧柏叶前后的差异代谢物，并通过HDPCs实验确定起效物质。结果表明，植物乳植杆菌CCFM1348发酵侧柏叶后，发酵上清中芥子酸、槲皮素、没食子酸、柚皮素、杨梅素、原儿茶酸、圣草酚和芹菜素的含量增加。细胞实验结果表明，芥子酸、没食子酸、柚皮素、杨梅素和芹菜素均可显著促进HDPCs增殖，分别提高了54.05、26.48、17.83、10.47和10.57%。分子水平上，芥子酸可以显著促进HDPCs中Wnt5a、CyclinD、LEF1的表达和VEGF的分泌。柚皮素可以显著上调角质形成细胞生长因子（Keratinocytegrowthfactor，KGF）的表达。柚皮素、圣草酚、杨梅素和芹菜素均可显著抑制HDPCs中TGF-β2的表达。圣草酚、杨梅素和原儿茶酸均可抑制BAX的表达。槲皮素、没食子酸和杨梅素可显著促进HDPCs分泌IGF-1。芥子酸可抑制TGF-β1的分泌。表明植物乳植杆菌CCFM1348可能通过提高侧柏叶中的功效多酚类化合物含量，增强侧柏叶的生发功效。
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