摘要
家蚕核型多角体病毒（Bombyxmorinucleopolyhedrovirus,BmNPV）和家蚕微孢子虫（Nosemabombycis）是对家蚕具有高致病性的两种病原体，这两种病原体引发的蚕病在养蚕基地时有爆发，致死率高，对家蚕养殖业构成了严重威胁，常规的家蚕微孢子虫和BmNPV检测，主要根据外观症状和显微镜镜检方法，而且只有到发病晚期才能做出正确诊断，在时效性、特异性和灵敏性上均存在不足，因此，生产上亟需开发具有高灵敏度、高特异性、低成本、适用于基层蚕种场和检疫部门的BmNPV和微孢子虫的新型检测技术。 CRISPR/Cas系统在切割靶序列后可激活非特异性切割功能，这一特性为病毒基因检测提供了新的手段。CRISPR/Cas系统与等温扩增技术结合提高了检测的灵敏度。基于CRISPR/Cas系统，本文旨在建立一种针对家蚕主要病原体的快速可视化检测技术。主要研究结果如下： 1、LwCas13a蛋白的大量表达与纯化 通过pC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a表达载体表达LwCas13a重组蛋白。研究发现，当使用Rosetta2（DE3）大肠杆菌表达时，目的蛋白的表达量高于BL21（DE3）大肠杆菌。通过对表达温度和IPTG添加量的优化，发现16℃0.5mMIPTG诱导条件下，目的蛋白的表达量最高且在此条件下LwCas13a蛋白主要以可溶性蛋白表达。本研究利用16℃0.5mMIPTG诱导条件大量表达了可溶性LwCas13a重组蛋白，通过SUMO蛋白酶去除SUMO蛋白标签后获得了具有生物活性的LwCas13a蛋白。 2、基于CRISPR/Cas13a系统的BmNPV快速可视化检测技术的建立与评估 根据BmNPVgp64基因的核酸序列，选取了28个核苷酸作为检测位点，并根据检测位点设计了RPA引物和特异性识别gp64基因的crRNA。通过体外转录实验，成功获得了用于检测的crRNA。根据不同的信号输出工具，研究设计了不同的ssRNA报告分子。通过对不同反应组分和CRISPR反应时间的优化，成功建立了分别以酶标仪、手持式荧光检测设备以及试纸条作为检测输出工具的基于CRISPR/Cas13a系统的BmNPV快速可视化检测技术。对该检测技术进行灵敏度评估，结果表明该检测技术的灵敏度为1copy/μL的阳性标准质粒和1fg/μL的BmNPV基因组标准品。利用CRISPR/Cas13a检测技术对感染家蚕微孢子虫（Nosemabombycis）、家蚕质型多角体病毒（Bombyxmoricytoplasmicpolyhedrosisvirus,BmCPV）、家蚕二分脓核病毒（Bombyxmoribidensovirus,BmBDV）和球孢白僵菌（Beauveriabassiana）的家蚕中肠组织进行检测，研究发现，除阳性对照样本外，该技术对其余样本的检测结果均为阴性，表明该技术具有较好的特异性。最后，通过对实测样本的检测，研究发现利用该检测技术最早可在感染12h的家蚕中肠以及3h的BmN细胞中检出BmNPV，通过对感染72h后的家蚕其他组织进行检测，均可检出BmNPV，研究证实了该技术具有较高的准确率，试纸条的使用实现了对BmNPV的无设备检测。 3、基于CRISPR/Cas13a一步法检测体系及基于CRISPR/Cas12a/Cas13a双靶标检测体系的建立与评估 利用免核酸提取试剂，从家蚕血液样品中可直接获得用于CRISPR/Cas13a检测的DNA粗提物。研究发现结合免核酸提取试剂的CRISPR/Cas13aBmNPV检测技术的灵敏度可达2.9×102copies/μL，最早可在感染6h时检出BmNPV。为进一步提高该检测技术的实用性，我们将RPA反应和CRISPR检测反应置于一管中进行，建立了家蚕血液免提取的BmNPV一步法快速可视化检测技术，利用该技术检测BmNPV，其灵敏度可达2.9×102copies/μL，且检测结果能在30-40min内呈现。此外，我们根据Cas12a蛋白和Cas13a蛋白非特异性切割活性的不同，分别设计了ssDNA和ssRNA探针用于双靶标的检测。结合免核酸提取试剂，我们建立了可以同时检测BmNPV和家蚕微孢子虫的CRISPR/Cas12a/Cas13a双靶标快速可视化检测技术，利用标准品评估该检测技术的灵敏度，研究发现该检测技术的灵敏度为1pg/μL基因组DNA和103copies/μL阳性标准质粒。实测样本检测结果表明，建立的双靶标核酸检测技术最早可在同时感染了这两种病原48h后的家蚕中肠以及72h的家蚕血液中同时检出BmNPV和家蚕微孢子虫。 综上所述，本研究建立了一种新型的家蚕主要病原体快速可视化检测技术，该技术适用于BmNPV和家蚕微孢子虫的现场检测，具有操作简便快捷，无需大型昂贵仪器、灵敏度高、结果准确快速和可视化等优点，有利于在早期阶段控制家蚕病原体的发生与蔓延。
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