摘要
大口黑鲈（Micropterussalmoides）是一种被广泛养殖的鱼类。然而，随着养殖密度的增加，大口黑鲈经常被水中不同病原体感染。在本研究中，我们从患病大口黑鲈中分离出两株病原菌，对其进行16SrRNA和gyrB基因测序，以及形态学观察和生理生化特征分析，最终鉴定两株分离的病原菌为维氏气单胞菌（Aeromonasveronii）和鰤诺卡氏菌（Nocardiaseriolae）。此外，在维氏气单胞菌中鉴定出8个致病性毒力基因，分别与肠毒素、脂肪酶、弹性蛋白酶、群体感应、溶血素和粘附有关；在鰤诺卡氏菌中检测出8个毒力基因，分别与哺乳动物细胞侵入蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、分枝杆菌转移酶、硝酸还原酶亚基和细胞毒素/溶血素有关。药敏实验结果显示，分离出的维氏气单胞菌和鰤诺卡氏菌均对卡那霉素、链霉素、庆大霉素、新霉素、强力霉素、四环素、环丙沙星和左氟沙星敏感，对阿米卡星、头孢咪唑、氨苄西林、哌拉西林、羧比西林、苯唑西林、利福平、甲氧苄啶钠、万古霉素、美罗培南、亚胺培南和磺胺甲唑耐药。此外，在自然病鱼中观察到严重的组织病理病变，如典型的肉芽肿坏死中心、细胞变性、细胞坏死、出血和炎症细胞浸润。14天内维氏气单胞菌和鰤诺卡氏菌的LD50分别为7.94×105CFU/g和3.16×106CFU/g。此外，与单一病原菌感染相比，维氏气单胞菌和鰤诺卡氏菌的共感染造成更高的死亡率。结果表明，维氏气单胞菌和鰤诺卡氏菌均参与了大口黑鲈的疾病暴发，并且这两种细菌的同时存在加剧了疾病的发生进程。 为了探究大口黑鲈同时感染维氏气单胞菌和鰤诺卡氏菌后死亡率更高的原因，我们比较分析了维氏气单胞菌和鰤诺卡氏菌单、共感染后鱼体的免疫应答反应和组织中细菌载量的变化。结果显示，与对照组相比，细菌感染第7天和14天后大口黑鲈肝脏中抗氧化酶活性和血清中非特异性免疫酶活性显著（P＜0.05）下降。此外，细菌感染第7天和14天后肝脏、脾脏、头肾和肠道出现明显的病理病变，尤其共感染组中组织病理变化更严重。RT-qPCR检测结果发现，细菌感染后0-96小时脾脏和头肾免疫和凋亡相关基因的相对表达量出现明显上升（P＜0.05），更重要的是共感染组基因表达量更显著（P＜0.05）升高。在感染后第14天，鰤诺卡氏菌感染组的肝脏、脾脏和头肾细菌载量分别为105.54CFU/g、106.97CFU/g和106.61CFU/g；维氏气单胞菌感染组肝脏、脾脏和头肾的细菌载量分别为104.55CFU/g、107.76CFU/g和105.90CFU/g；共感染组肝脏、脾脏和头肾的两株细菌总量分别为1010.62CFU/g、1012.08CFU/g和1011.67CFU/g。该结果将有助于我们进一步了解鱼类感染维氏气单胞菌和鰤诺卡氏菌后的发病机制和宿主防御系统，并进一步加深我们对病原体与鱼类免疫系统之间的相互作用的认识。 为了研制出可以预防和治疗维氏气单胞菌和鰤诺卡氏菌病的有效疫苗，在本研究中，我们制备了维氏气单胞菌单个灭活疫苗、鰤诺卡氏菌单个灭活疫苗以及维氏气单胞菌和鰤诺卡氏菌二联灭活疫。通过免疫后血清酶活性、RT-PCR和ELISA试验来分析灭活疫苗对鱼体的免疫效果，结果表明，血清中溶菌酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性显著上升（P＜0.05）；脾脏和头肾组织中IL10、IL-1β、IFN-γ和CD4-1等基因的表达量显著增加（P＜0.05），其中二联灭活疫苗组免疫相关基因表达更显著增加（P＜0.05）；免疫后血清中产生抗维氏气单胞菌或鰤诺卡氏菌的特异性抗体，其中二联灭活疫苗组同时产生抗维氏气单胞菌和鰤诺卡氏菌的抗体。细菌攻毒后，通过进一步计算相对免疫保护率评价疫苗的保护效果，结果发现分别用维氏气单胞菌、鰤诺卡氏菌和（1∶1）混合细菌攻毒后，PBS组的保护率均为0，而二联灭活疫苗组的保护率分别为85.56%、33.33%和44.44%；维氏气单胞菌攻毒后，维氏气单胞菌疫苗组的保护率为63.89%；鰤诺卡氏菌攻毒后，鰤诺卡氏菌疫苗组的保护率为22.22%。这些结果表明，二联灭活疫苗有希望作为对抗维氏气单胞菌和鰤诺卡氏菌病的候选疫苗。 鰤诺卡氏菌是诺卡氏菌病的主要病原体，是一种典型的条件致病菌，对水产养殖业造成巨大危害。本研究基于Illumina平台，分析了前期分离出来的鰤诺卡氏菌21NS928的基因组序列。结果发现，鰤诺卡氏菌21NS928包含一个长度为7,723,096bp的环状染色体,G+C含量为68.3%，编码了7,336个蛋白质编码序列。利用KEGG数据库和碳水化合物活性酶（CAZy）数据库分析鰤诺卡氏菌21NS928的基因组序列，分别注释到了3575和1042个基因。同时，在菌株21NS928中发现了大部分抗生素耐药基因，其中大多数编码大环内酯类和四环素类抗生素。此外，通过比对毒力因子数据库（VFDB），预测到菌株中含有493个毒力基因。该研究结果进一步丰富对鰤诺卡氏菌毒力基因和耐药基因的认识，有助于了解鰤诺卡氏菌的发病机制，以及为后续开发新的潜在疫苗提供理论知识，从而更好地预防和治疗诺卡氏菌病。
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