摘要
苦荞是我国的重要小宗粮食作物和药食同源植物，因其体内含有丰富的黄酮类化合物而受到广泛的关注。黄酮类物质是一种天然存在的多酚类化学物质，也是植物体内重要的抗氧化剂，在植物生长发育和逆境胁迫响应方面具有重要作用。糖基化反应是黄酮类物质等次生代谢物的合成过程中的关键修饰步骤，经糖基化修饰后的次生代谢产物往往具有多样性和复杂性，而糖基转移酶是维持植物体内次生代谢物稳定所必需的酶，同时也是糖基化作用的关键酶，因此，克隆并研究苦荞糖基转移酶基因对探究其调节苦荞黄酮类物质合成和积累的作用机制有着重要意义。本研究以苦荞品种“川荞2号”为材料，利用同源克隆的方法克隆其糖基转移酶基因FtUFGT4，进行生物信息学分析和基因组织表达特异性分析；克隆FtUFGT4基因启动子，通过转基因拟南芥分析该启动子对干旱和盐胁迫的响应性；在大肠杆菌中诱导表达FtUFGT4蛋白，并检测其体外催化活性；通过遗传转化至拟南芥、烟草，分析FtUFGT4基因对黄酮类物质合成的作用。取得的主要研究成果如下： 1. 对“川荞2号”糖基转移酶基因FtUFGT4进行生物信息学分析，结果表明该基因CDS区全长为1395 bp，共编码464个氨基酸，其蛋白质分子量大小约为52.33 kDa，编码的蛋白属于糖基转移酶家族成员，是一个无明显跨膜结构的不稳定性蛋白，模拟分子对接分析发现槲皮素和山奈酚可作为FtUFGT4蛋白酶对应的底物。 2. 通过PCR技术扩增得到FtUFGT4基因上游约1500 bp启动子序列，命名为PFtUFGT4。用Plant CARE网站对PFtUFGT4的序列进行分析，发现其除了含有启动子的基本结构，还分布着光、胁迫和激素等响应元件。构建PFtUFGT4-GUS表达载体遗传转化至拟南芥，利用实时定量PCR鉴定了干旱和盐处理对GUS报告基因表达量的影响，分析结果发现，干旱和盐对GUS报告基因的表达具有明显的促进作用，还进行GUS组织化学染色，发现在正常情况下，野生型和PFtUFGT4-GUS转基因拟南芥叶片中均未观察到蓝色斑驳，经过NaCl、PEG处理后，在野生型拟南芥叶片上仍未观察到蓝色斑驳，而PFtUFGT4-GUS转基因拟南芥叶片上观察到明显的蓝色斑驳，与GUS基因表达情况一致，这些结果表明，FtUFGT4基因启动子能够响应干旱和盐胁迫。 3. 用ABA、SA、MeJA、NaCl、PEG和水对苦荞进行处理，并用实时定量PCR检测处理后苦荞根、茎和叶片中FtUFGT4基因的表达量，分析结果发现，在根中，经过处理后，FtUFGT4基因的表达水平无明显趋势；在茎中，经过NaCl和水淹处理后，其表达水平呈上升趋势，而经过ABA、SA、MeJA和PEG处理后，其表达水平整体则呈先下降后上升趋势；在叶片中：经过胁迫处理和激素处理后，其表达水平整体则呈上升趋势，这些结果表明苦荞中FtUFGT4具有组织表达特异性。 4. 构建苦荞FtUFGT4基因的原核表达载体，并使用IPTG作为诱导剂，成功在大肠杆菌中诱导表达FtUFGT4蛋白，用高效液相色谱仪（HPLC）进行体外酶活性检测，结果发现UDP-葡萄糖能在FtUFGT4的催化下，与槲皮素反应生成异槲皮素，表明FtUFGT4蛋白具有糖基转移酶活性。 5. 构建苦荞FtUFGT4基因的过表达载体，遗传转化至拟南芥和烟草，分别对过表达拟南芥和烟草叶片中的总黄酮含量和类黄酮通路基因表达量进行检测，分析结果发现，过表达拟南芥和烟草叶片中总黄酮含量显著高于野生型，并且过表达拟南芥和烟草叶片中黄酮合成相关基因FLS、PAL表达水平显著高于野生型。这些结果表明FtUFGT4可以通过调控类黄酮通路基因来实现对植物体内总黄酮含量合成和积累的调节。 综上所述，本研究初步证明FtUFGT4属于糖基转移酶基因家族，具有在体外促进合成异槲皮素的功能。其启动子响应干旱和盐胁迫，并且该基因可以通过促进黄酮合成相关基因FLS、PAL的表达从而提高总黄酮的含量。本研究结果可以为探究苦荞中糖基转移酶基因对黄酮类物质合成的作用机理提供重要的理论依据。
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