摘要
目的： 肝病影响着全球数以亿计的人，目前对终末期肝病的最为有效的方法是肝移植，然而可供移植的肝脏器官来源却非常有限。人诱导多能干细胞（hiPSC）来源肝细胞被认为是未来理想的移植替代物。但是，目前其诱导方法普遍存在着成本高，诱导效率低，体内定着置换困难等缺点，极大地限制了其大规模使用。由hiPSC来源肝细胞构建肝脏类器官能够真实模拟人体肝脏微环境，具有显著的移植治疗优势。同时为一个体外准确模拟肝病，开发治疗药物提供便利、有效的研究模型。本课题旨在诱导hiPSC分化为肝组织既有构成中多类型细胞，包括肝干细胞，肝窦内皮细胞和肝星状细胞等，最大程度模拟人体肝细胞生存和发育的微环境，并按适宜比例混合，借助三维多细胞培养系统，自律构建单一供体来源的肝脏类器官。 方法： 1. hiPSC 肝干细胞诱导肝实质细胞的阶段性诱导和鉴定。hiPSC 在 511 包被的培养板上进行为期三天的定形内胚层细胞诱导。第三天收集少量细胞提取mRNA检测内胚层细胞相关基因表达，包括FOXA2、SOX17、GATA4和GATA6。培养三天后，改用肝细胞分化培养基。在培养的第3、8和18天提取mRNA检测肝细胞干性和功能相关基因表达水平，如AFP、CK19、ALB、CYP2C9等。通过比较各时间点基因表达水平变化，确定最接近肝干细胞的分化阶段。 2. hiPSC 来源肝脏非实质性细胞诱导 1） 肝窦内皮细胞（LSEC）的诱导。 hiPSC在511包被的培养板上进行为期三天的定形中胚层细胞诱导。第三天收集少量细胞提取mRNA检测中胚层细胞相关基因表达，包括T和MESP1。培养三天后，改用内皮细胞分化培养基。在培养的第8天提取mRNA检测内皮相关基因表达水平，如CDH5、PECAM1和KDR。最后改用肝脏特异性内皮细胞分化培养基。 2） 肝星状细胞（HSC）的诱导。 hiPSC在511包被的培养板上进行为期三天的定形中胚层细胞诱导。第三天收集少量细胞提取mRNA检测中胚层细胞相关基因表达，包括T和MESP1。培养三天后，改用星状细胞分化培养基。在培养的第8和12天提取mRNA检测星状细胞相关基因表达水平，如DES、PDGFRB、COL1A1和ACTA2。 3. 肝非实质性细胞参与的肝脏类器官构建 诱导非实质细胞按1∶1、1∶2或2∶1的比例向培养系统中添加先前诱导的肝干细胞，同时添加肝细胞成熟培养基 HCM，每两天更换三位培养体系中培养基并观察类器官形态变化。于培养第 10、15、20 天取样进行类器官功能分析。 结果： 本研究使用多种多能干细胞株，优化细胞分化培养条件，对比形态学表现，基因表达与蛋白表达变化等，建立最佳肝实质细胞分化方案。分化末期细胞形态学与原代肝细胞高度一致。筛选非实质细胞分化方案，诱导生成肝窦内皮细胞和肝星状细胞，相关基因标志物表达量与人肝脏非实质细胞具有一定的相似性。最后构建多种肝细胞培养体系，肝脏功能远高于单一细胞培养体系。 结论与展望： 本研究成功建立优化的肝实质诱导分化方案；探索了肝窦内皮细胞和星状细胞分步诱导的诱导培养条件；初步构建多细胞培养体系。 未来肝脏类器官能够模拟构建人体肝脏组织结构及功能，为构建体外疾病模型提供平台；为提高体内移植成功率奠定基础；为推动肝脏修复和再生效率提供动力；为建立高效药物筛选平台，大规模新药开发提供策略；对探索器官的发生发育、衰老和病变具有重要的学术意义和应用价值；对实现再生医疗技术的创新与突破具有重大影响。
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