摘要
根据国际蓝莓组织的报告，在过去五年中，中国的蓝莓产量增长了3倍多。贵州是西南乃至全国最早大规模开展蓝莓引种驯化和应用栽培的地区。贵州省丹寨县兴仁镇具备适宜蓝莓良好生长的气候和土壤条件，当地在产业发展方面取得了良好进展，共同促成了该地区蓝莓种植规模大、产量高、品质较为突出的特点，使其被冠以“蓝莓小镇”的美誉。市场上的蓝莓酒在感官特性方面存在同质化的问题，主要是由于商业酿酒酵母菌种的普遍使用导致微生物发酵群落的简化。研究表明，从自然发酵蓝莓果酒中分离筛选出的优良酵母菌株具有开发成优良商品果酒酵母的潜力。因此，对贵州省丹寨地区的优质蓝莓原料进行全面的野生酵母菌多样性研究，不仅有助于开发和利用当地的野生酵母菌资源，而且为进一步挖掘和应用具有优良特性的蓝莓专用酵母提供菌种来源。这将有助于生产具有独特风格和高品质的蓝莓酒，满足消费者对蓝莓酒多样化和个性化的需求。 本研究对贵州丹寨蓝莓种植基地采摘的3种蓝莓进行自然发酵，对发酵液中的野生酵母进行资源调查和优良菌株筛选。研究工作为：从蓝莓自然发酵液中分离、筛选出不同发酵时期的野生酵母并进行保藏研究；利用WL培养基对所筛酵母在形态学上进行初步分类鉴定；采用高通量测序技术和数字PCR定量技术对野生酵母菌落分布特征进行分析，同时比较依赖于培养的鉴定方法与高通量测序技术和数字PCR定量分析蓝莓自然发酵过程酵母菌群落组成的异同；在自然发酵后期分离出的野生酵母的发酵特性进行分析，将筛选得到具有优良发酵特性的酵母菌进行分子身份的确定。最终选用具有优良发酵特性的酵母进行蓝莓汁发酵，探究不同酵母对蓝莓酒理化指标、酚类物质、有机酸以及风味物质的影响。具体研究结果如下： （1）通过高通量测序技术，从3种蓝莓自然发酵过程中鉴定出至少50种真菌。其所鉴定出的酵母菌种类主要有：Schizosaccharomyces japonicus、Pichia kudriavzevii、Naumovozyma castellii、Candida orthopsilosis、Malassezia restricta、Ogataea parapolymorpha等。在X和C品种发酵初期，非酵母菌占主导地位，随着发酵的进行， S. japonicus 逐渐演变为主导菌直至发酵结束。而 F 品种蓝莓则是一开始就以 S.japonicus为优势菌，并在整个发酵过程中维持主导地位。结合数字PCR定量技术可知，在自然发酵过程中，3个蓝莓品种的真菌浓度范围在1×104~7.68×105 cp/mL之间。 （2）通过培养依赖性方法从3种蓝莓中分离出12种具有代表性菌落特征酵母菌，经过对比后划分为6个酵母菌属。此外，所检测出的菌群浓度能达到1×107 cfu/mL以上。高通量测序技术和依赖于可培养的技术所揭示的结果具有一定相似性：Schizosaccharomyces在发酵中期和后期为优势菌，具备独立酒精发酵能力。然而，高通量测序结合数字PCR定量的方法检测出的微生物浓度低于依赖于培养的方法，且所测定出的菌种类型差别较大。高通量测序的结果显示X品种微生物组成结构较为复杂，而C、F品种则相对单一，而依赖于培养的方法的结果却截然相反。 （3）选用自然发酵后期分离出的132株野生酵母进行发酵特性研究。从中筛选出了43株发酵性能优秀的酵母菌株，对筛选出的43株酵母菌进行了5.8S-ITS-RFLP分析与26S rRNA基因D1/D2测序分析，鉴定为36株酿酒酵母、1株发酵接合酵母、2株文氏毕赤酵母和4株粟酒裂殖酵母。从43株酵母中，选出10株性能优良的菌株进行产酒精和挥发酸的测定，最后选出粟酒裂殖酵母 FBKL2.9SP-L14 和酿酒酵母FBKL2.9SC-L43进行蓝莓汁发酵。 （4）将两株酵母和CECA进行对比发酵分析。FBKL2.9SC-L43具有一定降解苹果酸的能力，FBKL2.9SP-L14具有相对较好的降解苹果酸和酒石酸的能力。两株酵母对蓝莓酒酚类物质的浓度和组成有显著影响。通过对挥发性物质检测，蓝莓汁中风味物质种类多，但是物质含量低，大部分为醛酮类和酯类物质，为蓝莓汁提供了花香。FBKL2.9SC-L43和CECA发酵的蓝莓酒中呈现花香的物质较多，而FBKL2.9SP-L14则是果香型物质偏多。 本研究通过高通量测序技术结合数字PCR定量分析的方法，首次在贵州丹寨地区对蓝莓自然发酵过程中的酵母菌多样性进行了深入分析。此外，研究还采用依赖于培养的方法作为辅助手段，比较与高通量测序技术和数字PCR定量分析蓝莓自然发酵过程酵母菌群落组成的异同。这一研究不仅为蓝莓酒生产加工专用酵母的开发以及商业化提供了理论基础和技术支撑，而且为酿造具有本地特色的蓝莓酒提供了重要的理论依据。
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