摘要
规模化肉牛养殖业扩张式发展过程中会产生和积累大量的粪污，由此所引发的环境污染问题日益严重。好氧堆肥作为农业固体废弃物资源化的主流处理技术，微生物在其中发挥着重要作用。牛粪中纤维素含量高，这些纤维素在牛粪好氧堆肥过程中很难得到快速有效地降解，因此牛粪堆肥发酵进程将会受到限制。生物法降解纤维素是一种经济、环保的工艺，微生物可以分泌各种酶类来实现纤维素的选择性降解。因此，为丰富纤维素微生物降解体系，促进牛粪堆肥腐殖化进程，寻求纤维素高效分解功能微生物成为实现粪污减量化、无害化和资源化的重要途径。本研究以堆肥样品、腐败秸秆和腐殖化土壤为菌源，分离驯化出纤维素分解功能微生物。在探究菌株最佳培养条件的基础上，以菌棒渣为载体制备纤维素降解固体复合菌剂，并将复合菌剂应用于牛粪好氧堆肥过程中，探讨复合菌剂的最佳投加量。最后，借助宏基因组高通量测序技术和光谱学表征手段分析堆肥过程中微生物群落特征、关键酶以及物质结构变化，推测复合菌剂促进牛粪堆肥腐殖化的机制。以期为畜禽粪便好氧堆肥微生物强化策略和腐殖质形成机制研究提供一定的理论依据。主要研究内容和结果如下： （1）纤维素分解菌的筛选及鉴定 从堆肥样品、腐败秸秆和腐殖化土壤中成功分离出22株纤维素分解菌，其中细菌 J-30-3、W-30-4和真菌 J-2的纤维素降解能力最强，其内切 β-葡聚糖酶活分别达到了 22.16、17.66 和 29.67 U/mL。平板对峙实验结果表明，3 株菌两两之间无拮抗作用。分子生物学鉴定结果显示，细菌 J-30-3 为枯草芽孢杆菌，细菌W-30-4为副地衣芽孢杆菌，真菌J-2为白囊耙齿菌。 （2）菌株培养条件优化及复合菌剂的制备 评估了3株纤维素分解菌在不同温度、初始pH、接种量、碳源和氮源培养条件下的生长情况，实验结果显示，枯草芽孢杆菌的最佳培养条件为 30℃、初始pH为8、接种量为20%、碳源为葡萄糖、氮源为胰蛋白胨；副地衣芽孢杆菌的最佳培养条件为 25℃、初始 pH为 6、接种量为 25%、碳源为蔗糖、氮源为磷酸二氢铵；白囊耙齿菌的最佳培养条件为 30℃、初始 pH 为 6、接种量为20%、碳源为可溶性淀粉、氮源为胰蛋白胨。将各菌株接种至发酵培养基中，于最佳培养条件下扩大培养，以菌棒渣为载体，将 3 株高效纤维素分解菌株等比例混和制备纤维素降解固体复合菌剂，固体复合菌剂的有效活菌数为 2.4× 108 cfu/g，内切 β-葡聚糖酶活为 35.7 U/mL。 （3）复合菌剂投加量对堆肥效果影响研究 复合菌剂分别以 0.5%、1.5%和 2.5%的添加量接种至牛粪好氧堆肥体系，并设置不添加复合菌剂的对照组。堆肥各项腐熟度指标测定结果显示，与对照组相比，添加复合菌剂延长了堆肥高温持续时间，提高了堆肥周期内的整体温度，持续的高温也促进了有机质的快速分解和堆料含水率下降。堆肥结束时，添加 1.5%复合菌剂的实验组堆肥产品发芽指数、木质纤维素降解率和腐殖化指数最高，分别达到了 92.20%、42.29%和 2.85，说明 1.5%的添加量是复合菌剂的最佳投加量。 （4）堆肥过程中微生物群落演替-有机质转化的耦合机制分析 通过宏基因组测序结果可知，接种复合菌剂改变了堆肥微生物群落结构和演替特征，提高了有机质分解功能菌株的丰度和碳水化合物活性酶的表达量。三维荧光-平行因子分析结果显示，小分子类物质荧光强度随堆肥时间的推移而逐渐减弱，腐殖酸和腐殖质类物质的荧光强度持续增加。傅立叶变换红外光谱分析结果表明，酚、醇类等化合物（3410-3384 cm-1），木质素、脂肪族、碳水化合物（2950 cm-1），氨基酸（1651-1641 cm-1）的峰普遍降低，大分子有机物被逐渐分解转化，以美拉德反应和木质素-蛋白理论为途径的堆肥腐殖化正在发生。此外，以微生物细胞成分为腐殖质前体物质的生物途径也可能在牛粪好氧堆肥腐殖化过程中发挥重要作用。
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