摘要
目的：骨关节炎（Osteoarthritis, OA）发病与滑膜炎症相关，最新研究表明细胞焦亡表型也参与其中，然而相关机制目前尚未明确。本研究通过加权基因共表达网络分析（Weighted correlation network analysis, WGCNA）机器学习方法及生物信息学分析方法鉴定OA滑膜中细胞焦亡差异表达基因并识别相关生物标志物，通过构建多维作用网络并进行免疫浸润分析明确相关相关基因及生物标志物在OA中的作用机制，并针对相关标志物挖掘潜在的治疗药物。 方法：使用GEO数据库在线分析工具GEO2R和WGCNA机器学习算法筛选获取OA滑膜组织相关数据集GSE55235差异表达基因，与GeneCard数据库中细胞焦亡基因取交集得到细胞焦亡OA 基因（Pyroptosis-related Differentially Expressed Genes, PDEGs）。对 PDEGs 进行富集分析，筛选相关基因可能涉及的生物学过程及参与疾病发生发展相关的信号通路。以PDEGs为基础构建转录因子-基因-miRNA多维网络，探讨PDEGs关联的转录及转录后调控机制。此外，通过构建蛋白互作网络探索相关蛋白质之间作用模式，并使用 Cytoscape 软件中的 cytohubba 插件的 Closeness、Degree、EPC、MCC 和MNC 5 种算法筛选各自排名前 20 的hub 基因，而后与 PDEGs 取交集后得到最终 OA 细胞焦亡生物标志物。在外部数据集GES1919及GSE77298中构建受试者工作特征曲线评估OA细胞焦亡生物标志物的疾病诊断效能。进一步使用人滑膜细胞系构建OA细胞模型，通过体外实验验证各生物标志物基因表达水平。在 Coremine Medical 数据库中针对筛选到的OA细胞焦亡生物标志物挖掘潜在关联的中西医药物。最后使用CIBERSORTx对22种免疫细胞进行免疫浸润分析，构建相关性热图，明确OA细胞焦亡生物标志物与各类免疫细胞关联。 结果：1.筛选得到12个PDEGs，包括BHLHE40、BNIP3、CEBPB、CITED2、CXCL8、EGFR、FNDC4、ICAM1、IL-1β、IRAK3、JUN、PTGS2，富集分析结果表明这些基因主要富集于一氧化氮合酶活性、泛素样蛋白连接酶结合等生物学过程及核因子κB信号通路（Nuclear Factor kappa-B, NF-KB）以及表皮生长因子受体家族（ERBB receptor family, ERBB）等信号通路。以PDEGs构建转录因子-基因-miRNA多维网络，筛选到PDEGs相关的hsa-mir-124-3p、hsa-mir-34a-5p以及hsa-mir-155-5p等多基因关联miRNA，并锁定FOXC1 和NFKB1 两个核心转录因子。2.通过蛋白-蛋白互作网络分析进一步筛选得到7个OA细胞焦亡生物标志物，包括ICAM1、IL-1β、PTGS2、JUN、CEBPB、CXCL8、EGFR，于外部数据集GSE1919和GSE77298中进行受试者工作曲线分析表明7个OA细胞焦亡生物标志物具有良好的疾病诊断效能。实时荧光定量 PCR 实验结果表明，实验组OA细胞模型中 IL-1β、ICAM1、JUN、CEBPB、EGFR 表达水平同对照组相比具有显著差异。3.筛选到生物标志物关联的92种西药与89味中药，特别是CEBPB、CXCL8、ICAM1、IL-1β、PTGS2、JUN 等 6 个生物标志物关联密切的中西药，包括脂多糖、重组白细胞介素-1-β等4种西药，黄丝郁金以及丹参等4味中药。4.免疫浸润分析表明， M2 型巨噬细胞、浆细胞和静息状态下的肥大细胞是主要的免疫浸润细胞。疾病组中活化的肥大细胞、记忆B细胞等免疫细胞呈低表达，而M0型巨噬细胞、中性粒细胞等则呈高表达。进一步分析发现，多种免疫细胞间存在显著的相关性，且OA细胞焦亡生物标志物与多种免疫细胞之间呈显著相关。 结论：本研究采用WGCNA机器学习算法及生物信息学分析方法鉴定了12个PDEGs，进一步筛选得到7个OA细胞焦亡生物标志物，通过构建多维度交互网络，并进行关联药物筛选及免疫浸润分析为细胞焦亡角度进行OA诊治提供理论支持。
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