摘要
目的：探究TUBB4B在胰腺癌组织和细胞中的表达水平，明确TUBB4B的临床病理学意义和对于胰腺癌细胞增殖、迁移等细胞生物学功能的影响，并探索TUBB4B影响胰腺癌恶性生物学行为的潜在信号通路和分子机制。 方法：1．GEPIA数据库分析TUBB4B在胰腺癌等多种癌症组织中的表达水平。2．免疫组织化学分析TUBB4B蛋白在胰腺癌组织和癌旁组织中的表达情况，并与临床病理数据做相关性分析；细胞免疫荧光技术检测TUBB4B蛋白的细胞亚定位。3．qRT-PCR比较胰腺癌细胞系(PANC-1和BxPC-3)与正常胰腺导管上皮细胞系(HPDE6-C7)中的TUBB4B表达差异；小干扰RNA(siRNA)对人胰腺癌细胞系(PANC-1和BxPC-3)中的TUBB4B进行敲减，qRT-PCR确定敲减效率。4．敲减TUBB4B后PANC-1和BxPC-3细胞分别用CCK-8实验和克隆形成实验检测细胞增殖能力变化，细胞划痕实验分析细胞的迁移能力变化，流式细胞术检测细胞周期分布变化。5．Western-blot技术检测细胞周期相关蛋白以及NF-κB信号通路p65蛋白表达变化。 结果：1．GEPIA在线数据库的结果分析显示，与正常组织相比TUBB4B在胰腺癌等多种癌症中呈现高表达趋势(P＜0.05)。2．免疫组织化学显示TUBB4B蛋白在细胞核与细胞质中均有分布，在胰腺癌组织中表达高于癌旁胰腺组织中的表达(P＜0.0001)；细胞免疫荧光技术检测发现TUBB4B蛋白在正常胰腺导管上皮细胞系(HPDE6-C7)和胰腺癌细胞系(PANC-1和BxPC-3)中定位于细胞核与细胞质，在正常胰腺导管上皮细胞系和胰腺癌细胞系中胞核与胞质表达比例无明显差异。将TUBB4B蛋白在组织中的表达水平与患者临床病理数据做相关性分析发现，TUBB4B高表达的肿瘤组织具有更高的局部神经侵犯趋势(P＜0.05)。3．qRT-PCR检测显示，相较于正常胰腺导管上皮细胞系(HPDE6-C7)，TUBB4B在胰腺癌细胞系(PANC-1和BxPC-3)中呈高表达趋势；3条siRNA序列经qRT-PCR分析在两株胰腺癌细胞系中均可对TUBB4B进行不同程度敲减，其中si-701的敲减效率较好且稳定，故选择si-701在两种癌细胞中进行后续实验。4．CCK-8实验检测短期(72h )增殖能力发现TUBB4B敲减后BxPC-3细胞增殖能力明显下降(P＜0.05)，PANC-1细胞增殖能力下降，但无显著差异(P＞0.05)。克隆形成实验结果显示PANC-1和BxPC-3细胞中TUBB4B敲减后长期(10d)增殖能力均有明显下降(P＜0.05)。划痕愈合实验结果显示两种胰腺癌细胞系中TUBB4B敲减后迁移能力明显下降(P＜0.05)。流式细胞术检测发现TUBB4B敲减后PANC-1细胞S期阻滞(P＜0.01)。5．Western-blot检测发现在胰腺癌细胞系(PANC-1和BxPC-3)中敲减TUBB4B后其蛋白表达水平下降(P＜0.01)，在两株胰腺癌细胞系中敲减TUBB4B可抑制细胞周期蛋白依赖性激酶CDK2的表达(P＜0.01)及NF-κB通路p65蛋白表达(P＜0.001)。 结论：TUBB4B在胰腺癌组织和细胞系中高表达，表达水平与胰腺癌的局部神经侵犯行为呈正相关；敲减TUBB4B可抑制胰腺癌细胞(PANC-1和BxPC-3)增殖、迁移等恶性生物学行为；TUBB4B可能通过增加细胞周期蛋白依赖性激酶CDK2的表达和激活NF-κB信号通路来加强胰腺癌的恶性生物学行为。
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