摘要
目的：结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是严重威胁人类身体健康的肠道疾病，CRC的发生与生理、遗传、行为习惯、生活方式、肠道慢性炎症疾病等因素密切相关。目前，CRC发病率仅次于肺癌，死亡率也不断上升，且患者年龄呈年轻化趋势。在临床治疗中，将靶向疗法和免疫疗法与常规的手术、放疗及化疗等传统治疗手段相结合。这种综合治疗方法改善了患者的5年生存率，但需要指出的是，部分临床患者仍对现有治疗方案不敏感，进而引起肿瘤转移造成预后不良。因此，我们需要对CRC进展过程中的分子机理进行深入研究，寻找新的靶标及临床治疗药物，提升患者临床治疗效果。α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid,AKG）是谷氨酸的前体，也是三羧酸循环中的关键中间体，具有多种生理功能。最近研究表明，AKG能在肠道癌变过程中发挥调节作用，干预CRC的进展。因此，本研究将进一步探究AKG对CRC的作用及其机理，这将可能为CRC的治疗提供新的思路与方向。 方法：在二维细胞模型上，选用CRC细胞系HCT116和RKO细胞进行实验。首先，通过活细胞工作站捕获细胞并计算细胞汇合度分析不同浓度AKG对两株CRC细胞增殖能力的影响，筛选出半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration,IC50）。接着，按照是否加入AKG处理分为对照组和处理组，研究AKG对两株CRC细胞克隆形成、迁移和侵袭能力的影响，并探究AKG处理前后两株CRC细胞凋亡、周期、线粒体活性和DNA受损情况以及氧化应激指标的变化。为探讨AKG在CRC细胞中发挥作用的机理，通过实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）分析与氧化应激损伤相关基因GPX4、NRF2、KEAP1、SOD和CAT以及与凋亡相关基因CASP3、BAX和BCL2表达水平的变化。为进一步研究AKG抑制CRC细胞恶性生物学行为的分子机理，对AKG处理前后的HCT116细胞进行转录组测序以及生物信息学分析，得到差异表达基因谱及功能与通路富集情况，分析AKG对CRC细胞的作用机制。在三维类器官模型上，收集内蒙古医科大学附属医院胃肠外科CRC根治术患者的原发性CRC组织和癌旁≥5cm结直肠正常组织建立结直肠类器官库。为了评估组织病理学特征，对成功建立的结直肠类器官进行苏木素-伊红（hematoxylin-eosin staining,HE）染色，并对CRC类器官进行免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）。先用不同浓度AKG处理CRC类器官，通过Cell Titer-Glo?3D试剂检测三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）含量并筛选出AKG处理CRC类器官的IC50。接着，采用包埋、切片、HE染色方法分析AKG对CRC类器官组织结构和形态的影响。再应用TUNEL绿色荧光染色检测AKG处理前后CRC类器官的凋亡情况。随后，通过qRT-PCR分析AKG处理CRC类器官后基因表达变化是否与CRC细胞一致。最后，应用IHC检测AKG处理前后的CRC类器官中Ki67和氧化应激损伤相关蛋白GPX4、NRF2和KEAP1的变化，在三维CRC类器官模型上验证AKG对CRC的抗癌作用及其机理。 结果：1.AKG抑制HCT116和RKO细胞的增殖且呈剂量依赖性，并对两株CRC细胞的克隆形成能力有抑制作用。2.AKG对HCT116和RKO细胞的迁移和侵袭能力有明显的抑制作用。3.细胞凋亡(Annexin V-FITC/PI)实验显示：AKG可显著诱导HCT116和RKO细胞凋亡。TUNEL凋亡检测证实了AKG促进两株CRC细胞发生凋亡。流式细胞术检测周期发现：AKG处理两株CRC细胞后，HCT116细胞主要阻滞在G2期；RKO细胞主要阻滞在G1期。4.线粒体红色荧光探针检测发现：AKG处理后的两株CRC细胞线粒体活性受到明显抑制。γH2AX免疫荧光染色检测结果显示：AKG处理后的两株CRC细胞DNA受损。检测氧化应激指标还原型谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）发现：AKG处理后的HCT116和RKO细胞中ROS水平、MDA含量升高；而GSH含量、SOD活性降低。5.qRT-PCR结果表明：AKG处理后的HCT116和RKO细胞中，抗氧化基因GPX4、NRF2、SOD和CAT的表达降低、促氧化基因KEAP1的表达升高以及促凋亡基因CASP3和BAX的表达升高、抗凋亡基因BCL2的表达降低。6.根据转录组测序结果得到：基因差异热图显示AKG处理前后HCT116细胞的基因表达存在差异；GO分析表明AKG可以从低氧调控、细胞增殖抑制、细胞死亡促进及DNA断裂修复等过程抑制CRC进展；KEGG通路富集显示AKG发挥作用与DNA修复、代谢途径以及p53、MARK和HIF-1信号通路具有相关性。7.收集CRC根治术患者样本，成功建立结直肠类器官库，并进行HE和IHC染色。可以发现患者来源的类器官保留了亲本组织的组织特征，细胞核和细胞的整体形态都与来源组织保持高度一致。8.检测不同浓度AKG处理前后的CRC类器官中ATP含量结果显示：AKG对CRC类器官有显著抑制作用。9.应用HE染色显示：AKG处理后的CRC类器官皱缩、组织结构发生空泡、崩解，甚至碎裂。TUNEL凋亡检测显示：AKG促进CRC类器官发生凋亡。10.qRT-PCR结果表明：AKG处理后的CRC类器官中抗氧化基因GPX4、NRF2、SOD和CAT的表达降低、促氧化基因KEAP1的表达升高以及促凋亡基因CASP3和BAX的表达升高、抗凋亡基因BCL2的表达降低。IHC结果显示：与对照组相比，处理组CRC类器官中的Ki67表达降低，氧化应激损伤相关蛋白GPX4、NRF2表达减弱、KEAP1表达增强。 结论：1.AKG有效地抑制HCT116和RKO细胞的增殖、迁移、克隆形成和侵袭，并引起ROS蓄积、氧化应激损伤、DNA受损和线粒体活性降低，从而促进CRC细胞凋亡、抑制CRC的进展。2.AKG通过降低抗氧化基因GPX4、NRF2、SOD和CAT的表达、升高促氧化基因KEAP1的表达以及升高促凋亡基因CASP3和BAX的表达、降低抗凋亡基因BCL2的表达来抑制CRC的进展。3.AKG对CRC类器官的生长有显著抑制作用，使得CRC类器官皱缩、组织结构发生空泡、崩解，甚至碎裂等形态改变，促进CRC类器官凋亡。4.AKG处理后，CRC类器官氧化应激损伤及凋亡相关基因的表达变化与CRC细胞基本一致，氧化应激损伤相关蛋白GPX4、NRF2及KEAP1的表达与相应基因的表达一致，以及Ki67的表达水平在AKG处理后显著降低。
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