摘要
目的：利用D-半乳糖诱导的C57BL/6小鼠肾衰老模型，探讨6-姜烯酚对衰老所致肾损伤的保护作用是否与PI3K/AKT/FoxO3信号通路介导的自噬相关。 方法：将72只雄性C57BL/6小鼠随机分6组，分别为对照组、D-半乳糖（D-gal）组、低、中、高剂量6-姜烯酚组和雷帕霉素（RAPA）组。对照组：灌胃0.01mL/g溶剂后腹腔注射等量PBS；D-gal组：灌胃等量溶剂，腹腔注射D-gal（200mg/kg/d）；低剂量6-姜烯酚组：腹腔注射等量D-gal，灌胃6-姜烯酚（5mg/kg/d）；中剂量6-姜烯酚组：腹腔注射等量D-gal，灌胃6-姜烯酚（10 mg/kg/d）；高剂量6-姜烯酚组：腹腔注射等量D-gal，灌胃6-姜烯酚（20mg/kg/d）；RAPA组：腹腔注射等量D-gal，同时注射雷帕霉素（2mg/kg/d）。各组实验持续42天。测定血清中肌酐（CRE）和尿素氮（BUN）的含量来检测小鼠的肾脏功能。苏木素-伊红（HE）染色观察小鼠肾组织的病理结构。马松（Masson）染色检测小鼠肾组织胶原沉积情况。β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色观察小鼠肾组织衰老情况。检测肾组织匀浆中超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力及丙二醛（MDA）含量来反映肾组织的氧化损伤程度。对小鼠肾组织中mRNA进行测序，对测序所得差异基因进行GO和KEGG富集分析。实时荧光定量PCR检测小鼠肾脏组织Beclin1、LC3、Cdkn1a、PI3K、AKT、FoxO3基因表达水平。免疫组化（IHC）检测小鼠肾脏组织内自噬标记蛋白Beclin1、LC3B的表达水平。蛋白质免疫印迹（western blot，WB）法用于分析PI3K/AKT/FoxO3通路相关蛋白表达水平。 结果：与对照组相比，D-gal组的脏器系数降低（P＜0.05），降低了12.45%；与D-gal组相比，不同剂量6-姜烯酚组脏器系数均升高，其中中剂量组差异有统计学意义（P＜0.05）。对各组小鼠血清中的CRE和BUN含量进行测定，与对照组相比，D-gal组小鼠BUN和CRE含量升高（P＜0.05）；与D-gal组相比，不同剂量6-姜烯酚组BUN和CRE含量均降低（P＜0.05），其中中剂量组最低。HE染色和Masson染色结果显示，D-gal组小鼠肾脏可见肾小体直径增大，肾小球松散，部分肾小管萎缩，肾间质可见明显蓝染胶原纤维。6-姜烯酚组小鼠肾小球萎缩症状得到改善，肾小体形态较规整，肾小管形态也逐渐恢复，肾间质蓝染胶原纤维也显著减少。SA-β-Gal染色结果显示，D-gal组小鼠肾脏蓝染面积较多，颜色更明显。6-姜烯酚组蓝染区域减少。对抗氧化指标进行检测发现，与对照组相比，D-gal组小鼠肾脏SOD和GSH-Px活性分别降低了32.16%和28.12%，MDA含量升高了99.14%。与D-gal组相比，不同剂量6-姜烯酚可提高小鼠肾脏中SOD（P＞0.05）和GSH-Px（P＜0.05）的活性，降低MDA含量（P＜0.05）。GO和KEGG富集分析发现相关差异基因主要参与了蛋白质磷酸化的正向调节、凋亡信号途径、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、FoxO信号通路等。qRT-PCR结果表明，与对照组相比，D-gal组的Beclin1、LC3、Cdkn1a、AKT、FoxO3基因表达水平升高（P＜0.05），PI3K基因表达水平升高（P＞0.05）。与D-gal组相比，6-姜烯酚组的LC3、Cdkn1a、PI3K和FoxO3基因表达水平降低（P＜0.05），AKT和Beclin1基因表达水平降低（P＞0.05）。免疫组化结果显示，与对照组相比，D-gal组阳性染色增加，说明Beclin1和LC3B蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与D-gal组相比，6-姜烯酚组阳性染色减少，表明Beclin1和LC3B蛋白表达水平降低（ P＜0.05 ）。Western blot 结果显示，与对照组相比， D-gal 组p-AKT/AKT显著降低（P＜0.05），p-FoxO3/FoxO3也降低（P＞0.05）；与D-gal组相比，6-姜烯酚组p-AKT/AKT和p-FoxO3/FoxO3显著升高（P＜0.05）。 结论：6-姜烯酚对于衰老所致肾功能损害有保护作用，其机制可能与抑制自噬以及调控PI3K/AKT/FoxO3信号通路有关，为进一步研究衰老所致肾功能损害的药物研发提供科学依据。
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