摘要
肾细胞癌起源自肾小管上皮细胞，是泌尿系统中常见的恶性肿瘤之一。根据肾细胞癌的组织和分子特性可分为肾透明细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾乳头细胞癌、和一些未分类的亚型。其中肾透明细胞癌占所有病例的75%左右，是肾细胞癌常见的组织学类型。研究发现，虽然由于肾透明细胞癌诱导的死亡率在下降，但发病率一直在上升。长链非编码RNAs(long noncoding RNAs, lncRNAs)是一类长度大于200个核苷酸的ncRNAs，可通过参与不同的分子机制调控细胞多种生物学功能。近些年来的研究已经表明，lncRNAs可在转录水平、转录后水平以及翻译水平等多种方式参与肿瘤的发生、发展、转移以及侵袭，可作为肿瘤诊断预后标志物，以及治疗的潜在靶点。临床上，大多数肾透明细胞癌患者直至晚期才被确诊，从而导致预后极差，目前靶向药物的治疗方式在肾透明细胞癌的治疗上取得了一定的疗效，但不同的个体之间疗效差别较大，因此寻找肾透明细胞癌相关预后潜在靶点对肾透明细胞癌的诊断与治疗具有重要意义。因此，本研究旨在鉴定潜在的lncRNAs，并探究lncRNAs在肾透明细胞癌中发挥的作用、分子机制以及临床意义，为肾透明细胞癌的治疗提供新的理论基础。主要研究结果如下： 1.DRAIC在肾透明细胞中的分子特征和功能 通过从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)中下载四种癌种(肺鳞状细胞癌、肺腺癌、肾透明细胞癌和肾上腺皮质癌)中lncRNAs的预后信息进行分析，得到14个lncRNAs在四种癌种中预后显著相关，且lncRNADownregulatedRNAInCancer(DRAIC)在四种癌种中高表达预后均较好。表征分析显示DRAIC主要定位于细胞核，在肾透明细胞癌细胞系中表达低于正常细胞系。功能上，使用短发夹RNAs和小干扰RNAs两种干扰策略敲低DRAIC之后，肾透明细胞癌细胞增殖、转移和侵袭能力均增强，过表达DRAIC之后，肾透明细胞癌细胞增殖、转移和侵袭能力均减弱。 2.DRAIC结合并调控hnRNPA2B1的蛋白表达 机制上，DRAIC同核不均一型核糖核蛋白A2B1(heterogeneous nuclear ribo-nucleoproteinA2B1, hnRNPA2B1)相互结合，且共同定位于细胞核。进一步分析鉴定到DRAIC通过多聚腺苷酸基序与hnRNPA2B1的精氨酸-甘氨酸-5-甘氨酸丰富结构域直接结合，并调节hnRNPA2B1的蛋白水平而不影响其信使RNA(me ssenger RNA，mRNA)水平。蛋白稳定性和泛素化实验发现，DRAIC通过与E3连接酶F-box蛋白11(F-Box Protein 11, FBXO11)竞争性结合hnRNPA2B1，阻止 hnRNPA2B1被泛素化-蛋白酶体途径降解，从而提高hnRNPA2B1的蛋白稳定性。功能挽救实验表明DRAIC通过hnRNPA2B1在肾透明细胞癌中发挥抑癌功能。 3.DRAIC/hnRNPA2B1共同调控下游效应分子IGF1R的稳定性 整合分析DRAIC/hnRNPA2B1转录组测序和hnRNPA2B1eCLIP数据显示共有195个基因共同被DRAIC/hnRNPA2B1调控且与hnRNPA2B1结合，这些基因主要富集于与细胞生长和转移相关的磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B经典信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)。PI3K-Akt信号通路中关键基因1型胰岛素样生长因子受体(type 1 insulin-like growth factor receptor, IGF1R)在DRAIC/hnRNPA2B1敲低细胞中的RNA稳定性以及表达量均显著上调。体外体内表型挽救实验表明IGF1R可以挽救DRAIC/hnRNPA2B1对肾透明细胞癌细胞增殖、转移和侵袭的影响，且DRAIC和hnRNPA2B1可以降低肾透明细胞癌对IGF1R小分子抑制剂OSI-906和BMS-754807的抵抗。与肾透明细胞癌癌旁组织相比，DRAIC和hnRNPA2B1在肾透明细胞癌中显著低表达，IGF1R在肾透明细胞癌中显著高表达。 4.hnRNPA2B1以m6A依赖的方式促进IGF1RmRNA的降解 通过在HepG2细胞中进行N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine , m6A)测序分析，通路富集分析发现受m6A修饰的基因主要富集在pathwaysincancer、focalad-hesion等信号通路。整合分析m6A测序数据以及hnRNPA2B1eCLIP测序数据显示hnRNPA2B1特异性识别IGF1RmRNA上的m6A修饰，体外m6A和hnRNPA2B1RNA沉淀实验进一步支持hnRNPA2B1以m6A依赖方式识别IGF1RmRNA。此外，我们发现m6A修饰促进IGF1RmRNA降解。随后，结合位点突变实验表明hnRNPA2B1通过阅读IGF1R蛋白编码区终止子附近的4个m6A修饰位点，从而发挥依赖m6A修饰的方式促进IGF1RmRNA降解的功能。 5.YBX1调控DRAIC的表达 质谱数据结合体外实验发现，DRAIC直接结合Y盒结合蛋白1(Y-box bind-ing protein 1, YBX1)蛋白，DRAIC不影响YBX1的表达，而YBX1负向调控DRAIC的稳定性从而影响表达。表型实验证实YBX1在肾透明细胞癌中通过DRAIC发挥促癌功能。 综上所述，本研究发现并证实了DRAIC在肾透明细胞癌中低表达，发挥抑制肾透明细胞癌的功能。DRAIC直接结合hnRNPA2B1，通过与FBXO11竞争性结合阻止hnRNPA2B1被泛素化降解从而稳定其表达。hnRNPA2B1以m6A方式调控IGF1RmRNA的稳定性。此外，IGF1RmRNA上的四个m6A位点被鉴定负责与hnRNPA2B1结合，同时YBX1结合DRAIC并促进其被降解。进而揭示了一个新的DRAIC/hnRNPA2B1/IGF1R信号轴调控肾透明细胞癌的发生与发展。
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