摘要
烟酰胺单核苷酸（NMN）存在于所有生命体中，是人体中重要辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的关键前体。由于口服NAD+无法被人体吸收，NMN作为间接提升体内NAD+含量的营养药物被广泛研究并用于保健和治疗。近年来， NMN在改善衰老相关的退行性疾病中发挥重要作用，已陆续被批准为化妆品、食品生产添加的原料。目前，NMN的生物法制备以酶催化为主，而提高催化途径中功能酶的催化效率、降低生产成本是酶催化法应用和发展的关键。本论文选择烟酰胺核糖激酶（NRK）作为研究对象，该酶以烟酰胺核糖NR和ATP为底物催化合成NMN。通过生物信息学分析，挑选五种不同来源的NRK，对酶的性质进行表征；通过半理性改造BEANRK，提高其酶活性和热稳定性；最后，选择催化效率最高的KLUNRK，同大肠杆菌来源的多聚磷酸盐激酶（PPK）偶联反应，首次运用DNA支架技术组装这一双酶偶联体系，提高了催化效果。主要研究结果如下： （1）NRK的筛选与表征：HNRK、KLUNRK、KPNRK三种酶已被报道并使用，它们分别来源于智人（Homo sapiens）、马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）、巴斯德毕赤酵母（Komagataella phaffii），在此信息基础上，通过结构建模和活性中心可视化，初步筛选了两种新来源的BEANRK和SPANRK，分别来源于球孢白僵菌（Beauveria bassiana）和绣球菌（Sparassis crispa）。它们的系统进化树分析表明，KPNRK、KLUNRK与人源的HNRK同源性最高，而BEANRK与HRNK之间的亲缘关系则比较远。随后，构建这五种酶的高效表达重组质粒，获得体外纯化的五种酶，测定它们的最佳温度、pH和金属离子添加种类。结果显示，HNRK的最佳催化条件分别为：55℃、pH 7、金属离子添加Mg2+和Na+；KPNRK为：45℃、pH 8、Mg2+；SPANRK为：50℃、pH 8、Mg2+和Ca2+；KLUNRK为：50℃、pH 8、Mg2+；BEANRK为：50℃、pH 6、Mg2+。随后，梯度添加底物NR，绘制酶促反应的动力学曲线。根据Km、Kcat以及Kcat/Km参数可知，五种酶中KLUNRK的底物亲和力最强；HNRK的转化率较快，但亲和力最弱。催化效率指数从高到底排列为：KLUNRK、BEANRK、SPANRK、KPNRK、HNRK。这表明BEANRK、SPANRK两种新酶具有良好的性能和潜在的应用改造价值。 （2）新酶 BEANRK 的半理性改造：将首次鉴定的催化性能最好的BEANRK作为半理性设计的对象，进一步提高该酶的催化活性和稳定性。利用多序列比对，同时根据增加亲水性、减小底物结合的空间位阻、减少活性部位的疏水侧链和增加结构稳定性的要求，设计了11个单点氨基酸的突变。单点突变的结果显示，突变体M1（V172K）具有最高的酶活性，相较于野生型（WT）提高了1.2倍，M1转化率可达到91%，热稳定性也得到一定提升。除此以外的单点突变体都不具有超越WT的酶活性，并且在组合突变中效果依旧不理想。突变体M1和底物双分子的对接结果表明，突变点V172K的改变，使其与底物NR形成了新的氢键。M1对接结果中，底物分子在活性中心的P环基序附近，并且与WT相比，M1中ATP的对接构象更有利于ATP的磷酸基团向NR转移。从整体相互作用力上看，M1在不破坏氢键网络的基础上，分别对两种底物形成了新作用力，有利于底物分子的稳定对接。 （3）最优酶KLUNRK的偶联催化：为了进一步提高酶的应用能力，以催化性能最好的KLUNRK为研究对象，联合ATP再生酶PPK构建双酶偶联催化反应体系。验证表明，添加偶联酶能够弥补底物ATP的缺失，相较于对照，偶联反应将NMN的合成量提升了1.22倍。为了更加稳定精确地实现双酶偶联，引入DNA支架技术，构建了KLUNRK和PPK的锌指蛋白支架，同时考察了不同DNA支架长度以及不同底物比例数量下的提升效果。结果表明，DNA双链支架越长，提升催化效果就越好。其中按照1∶1排列双酶的支架相较于总对照将NMN的合成量提升了2.37倍。进一步考察在减少初始底物ATP添加的条件下，酶支架体系的ATP再生效果。结果显示，该条件下长链支架体系的产物合成量平均提升了2.18倍，相比于足量ATP的添加，低浓度条件的提升更为明显。证明酶偶联扩充了ATP的供应，DNA支架则增加了酶的稳定性和局部亲和力，从而实现了催化效率的提高。
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