摘要
豌豆是我国重要的经济作物，在粮食、蔬菜和饲料等多个领域都有广泛应用，在全球范围内广泛种植。白粉病和灰霉病等真菌性病害是豌豆生产过程中重要的病害，尤其在华南地区高温高湿的天气条件下，这些病害更容易繁殖和传播，给豌豆产业带来了重大经济损失，严重威胁和制约了产业的发展。筛选和培育对真菌具有广谱抗性的豌豆品种被视为最经济、有效和环保的手段。针对这一现状，本研究对50个豌豆品种的白粉病和灰霉病的抗性水平进行鉴定，综合评价了不同豌豆品种对这两种真菌的抗病性，筛选共同高抗和高感品种。为了进一步了解不同抗感豌豆品种的生理响应差异，本文深入研究了灰霉菌和豌豆的互作过程，测定了ROS爆发、胼胝体沉积、病情发展中活性氧的积累情况和多种关键酶活性的变化，探究了外源植物激素茉莉酸（ JA ）、水杨酸（SA）和乙烯利（ET）对豌豆抗性的影响。此外，本文还通过RNA测序比较分析了不同抗性品种在灰霉菌侵染后的转录组数据，进一步探讨可能存在的抗病机制，对于豌豆真菌性病害的科学防治以及抗病育种具有重要的意义。主要研究内容如下： （1）对肇庆和佛山南海两地的50个豌豆品种进行白粉病病情调查，并根据叶片病情分级标准和对叶片中的白粉菌（Erysiphe pisi )进行RT-qPCR分子定量来确定白粉病的抗病性；进一步利用灰霉菌（Botrytis cinerea）孢子悬浮液接种方法对豌豆叶片进行离体侵染，根据叶片病斑大小以及病情发展变化情况来确定灰霉病的抗病性。综合分析两种真菌的抗性鉴定结果，共筛选出4个感病品种和5个抗病品种。选取了其中1个高感品种（PS-52）和1个高抗品种（PS-4），作为后续的研究材料。 （2）灰霉菌作为模式真菌，具有可人工培养，能够定量分析的优势。本研究以PS-52和PS-4为实验材料接种灰霉菌，观察不同抗病豌豆品种的生理响应差异。利用苯胺蓝染色方法探究灰霉菌和豌豆叶片的互作过程，对灰霉菌的4个关键生长时期——孢子附着高峰期、萌发高峰期、附着孢形成高峰期和菌丝生长高峰期进行观察和统计，发现高抗品种PS-4在早期能通过抑制灰霉菌孢子的萌发来抵抗灰霉菌的入侵，而叶片成分并非主要抑制因子。通过进一步测定豌豆对灰霉菌的早期响应过程中ROS的爆发和胼胝体的含量，对叶圆片进行鲁米诺测定发现flg22和几丁质诱导的ROS爆发在抗性品种中表现更快更强；通过苯胺蓝染色发现高抗品种的胼胝体的沉积数目更多，以上结果表明在高抗品种早期响应过程中，病原相关分子触发的免疫（PTI）发挥了重要作用。基于此，进一步测定了豌豆对灰霉菌的病情发展过程中ROS的积累和抗氧化酶活性， DAB和NBT染色结果表明高抗品种H2O2和O2.-的积累更少；通过酶活测定发现高抗品种抗氧化酶活性高且增长的更快，以上结果表明高抗品种在晚期响应过程中可能通过调控ROS水平和抗氧化酶系统来应对灰霉菌的侵害。此外，外源添加SA、JA、ET三种植物激素可以提高感品种PS-52的抗性，诱导获得性抗性（SAR）产生，进而增强对灰霉菌的抵抗能力。由此推测，高抗品种通过调控植物激素水平发挥植物抗逆相关功能。 （3）采用RNA-seq技术，对不同抗性豌豆品种接种灰霉菌18h和48h叶片进行转录组测序，结果如下：高感品种PS-52显著差异基因分别有2849、7083个；高抗品种PS-4显著差异基因分别有1675、4486个，表明灰霉菌对高感品种基因表达的影响大于抗病品种。GO分析显示，抗感品种term均富集在细胞过程、代谢过程、响应刺激、转录调节因子活性、转运蛋白活性、抗氧化活性、膜、膜部分、细胞等功能；而KEGG富集结果表明，在18h时，抗感品种富集的通路存在显著差异，高抗品种更多富集于抗病相关通路，而高感品种更多富集于代谢相关通路。在48h时，抗感品种富集的通路差异不大，表明早期是高抗豌豆品种启动抗灰霉菌反应的关键时期，MAPK信号通路、植物激素信号转导、植物与病原菌互作和次生代谢物合成等通路共同调控抗病反应。 综上所述，本研究通过真菌广谱抗病性鉴定，筛选出高抗和高感品种；通过生理响应分析，发现不同抗性豌豆品种在灰霉菌互作过程中，表现出较大的差异，高抗品种可能通过介导早期的抗性反应来抵御灰霉菌入侵，其中PTI免疫和激素信号发挥了重要作用；通过差异基因表达分析，发现早期是高抗豌豆品种启动抗灰霉菌反应的关键时期，能够快速诱导多种途径参与抗病反应，其中MAPK信号通路、植物激素信号转导、次生代谢物合成是重要的调控通路。
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