摘要
原位疫苗效应是诱导肿瘤细胞免疫死亡，释放大量的肿瘤相关抗原，激活机体自身抗肿瘤免疫的效应，是一种有效控制肿瘤的复发和转移的方式。研究发现铁死亡是一种细胞免疫原性死亡，可以诱导肿瘤释放抗原产生特异性免疫，从而增强抗肿瘤的免疫效应，在原位疫苗方面具有应用潜力。然而，肿瘤微环境中的过氧化氢含量不足，铁离子转化为亚铁离子的效率较低，限制细胞铁死亡，进一步限制其产生原位疫苗效应。同时，近期研究发现，肿瘤细胞早期铁死亡会限制肿瘤部位抗原呈递树突状细胞（（DC）的成熟，阻碍抗原递呈，从而抑制原位疫苗效应诱导的抗肿瘤免疫。因此，增强肿瘤部位铁死亡和促进DC细胞成熟，是增强原位疫苗效应，提高铁死亡抗肿瘤免疫效应的关键。 围绕上述铁死亡受限和DC成熟受阻两个关键科学问题，本课题构建肿瘤可注射原位凝胶疫苗。原位凝胶疫苗包括可注射凝胶PBA-PVA和诱导铁死亡纳米药物LOMV@Fe两部分，LOMV@Fe递送促H2O2生成的药物β-拉帕醌（β-Lapa）、免疫佐剂细菌外膜囊泡（OMV），以及金属酚醛网Fe-EGCG。本课题主要研究内容如下： 1.LOMV@Fe的构建以及表征。利用超高速离心法分离获得BL21大肠杆菌的细菌外膜囊泡（OMV）。通过动态光散射和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其粒径和特征性膜蛋白，结果显示，OMV初始水合粒径分布于42.67nm-100nm，在35kDa处显示出明显的外膜蛋白A蛋白条带，可用于后续研究。将脂溶性药物β-Lapa装载于OMV，Fe和EGCG在OMV往外侧螯合，形成金属酚醛网，由此获得LOMV＠Fe纳米粒。利用UV-Vis光谱扫描、DLS以及透射电镜（TEM），检测其粒径、电位、吸收光谱以及微观形貌。结果显示，与OMV相比，LOMV@Fe粒径增长，Zeta电位上升，呈球形形态。利用XPS对LOMV@Fe进行表面元素分析，结果显示，LOMV@Fe表面的金属酚醛网中Fe存在Fe2+和Fe3+两种价态。在酸性条件下，Fe能够从酚醛网中释放出来，EGCG能够将氧化后的Fe3+还原为Fe2+，形成铁循环。在体外LOMV@Fe能够产生羟基自由基，使MB溶液褪色、TMB溶液显色。此外，对于载体PBA-PVA可注射水凝胶，利用扫描电镜和动态剪切流变仪考察其内部结构以及力学性能。结果显示，水凝胶内部具有典型的三维网状结构，具有一定的力学强度以及剪切稀化特性，符合可注射条件。同时在H2O2模拟环境下，水凝胶能够响应性降解，释放诱导铁死亡纳米药物。 2.LOMV@Fe诱导肿瘤细胞ICD以及促进抗原递呈细胞DC成熟的体外研究。在细胞水平，采用DCFH-DA荧光探针监测4T1肿瘤细胞活性氧水平，利用Calcein-AM/PI法以及CCK-8法考察4T1细胞存活率。与此同时，利用检测试剂盒检测各项铁死亡相关指标。结果显示，β-Lapa与Fe联合使用显著提高细胞内ROS水平，诱导肿瘤细胞氧化应激，促进细胞铁死亡。LOMV@Fe处理6后，4T1细胞存活率仅为6.15%。利用免疫荧光染色考察纳米药物处理后4T1细胞免疫原性死亡相关指标。结果显示，LOMV@Fe处理后4T1细胞CRT暴露程度升高，HMGB-1分泌增加，出现显著ICD特征。随后，利用流式细胞术检测LOMV@Fe促BMDC细胞成熟作用。结果显示，LOMV@Fe能诱导BMDC细胞CD80和CD86表达水平升高。同时，LOMV@Fe处理后的4T1细胞上清也能促进DC细胞成熟。综上所述，LOMV@Fe能诱导细胞铁死亡，释放损伤相关分子模式，同时促进DC细胞成熟，改善铁死亡早期DC成熟抑制。 3.LOMV@Fe可注射凝胶疫苗体内效应研究。采用荷4T1乳腺癌Balb/c小鼠模型进行给药，探究凝胶对小鼠肿瘤生长的影响，绘制肿瘤生长曲线，并对肿瘤进行Hamp;E、TUNEL和Ki67染色。结果显示LOMV@Fe凝胶可显著抑制肿瘤生长，抑瘤率达57%。同时将肿瘤切除制备成细胞悬液，采用流式细胞术进行免疫细胞检测，结果显示LOMV@Fe凝胶能够显著诱导DC细胞成熟，增加肿瘤部位细胞毒性T细胞的招募。随后，基于手术切除可能残留的问题，构建手术半切除的双侧瘤模型，利用可注射原位疫苗在原位肿瘤部位进行填充、治疗，观测远端肿瘤生长，评估原位肿瘤疫苗激活全身抗肿免疫水平。结果表明，LOMV@Fe水凝胶联合免疫检查点抑制抗PD-L1能够抑制远端小鼠肿瘤。此外，使用载纳米粒水凝胶处理后的肿瘤细胞刺激健康小鼠，能够促进小鼠脾脏内效应记忆T细胞生成，激活持久性抗肿瘤免疫效应。 本课题构建一种肿瘤可注射原位凝胶疫苗，利用铁死亡以及OMV天然免疫佐剂效应，诱导肿瘤细胞免疫原性铁死亡，放大免疫佐剂促进抗原递呈细胞成熟的效应，激活机体抗肿瘤免疫反应，从而产生全身性抗肿瘤效应，有效抑制肿瘤生长，为肿瘤治疗性疫苗提供一个新思路。
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