摘要
铝毒是酸性土壤上限制农作物正常生长的重要因素。大量研究表明，在酸性土壤上施硼肥可以有效缓解铝毒，促进作物增产增收。根尖是铝（Al）积累的主要位点，而根尖过渡区是铝毒重要的感知和响应位点。铝毒诱导活性氧（ROS）爆发是导致根尖受损和生长抑制的重要原因。研究表明，硼（B）可以通过调节 ROS来降低铝对植物根尖的毒害作用，但其调节机理仍不清楚。本研究以中豌 6 号（ZW6）为试验材料，设置不同硼铝处理，利用激光共聚焦显微成像和免疫标记技术，研究 ROS组织和亚细胞水平分布变化，重点对过渡区ROS分布特征、酶活性、抗氧化剂含量和基因表达水平进行分析，研究 B如何调控ROS空间分布和平衡缓解豌豆根尖铝毒。主要研究结果如下： 硼缓解铝毒对豌豆根系生长的抑制作用：与+B（25 μM）相比，-B（0 μM）和Al处理（30 μM）下豌豆侧根生长受到显著抑制。与-Al相比，Al处理下豌豆侧根数量和表面积显著降低、侧根直径显著增粗；而供硼后可以有效缓解Al毒对豌豆侧根生长的抑制。利用桑色素（Morin）对豌豆侧根纵切面和横切面进行染色，结果表明：Al 主要聚集在根尖过渡区表皮和外皮层细胞的细胞壁和质外体空间；对原生质体进行 Morin 染色，发现细胞质中也有铝的累积。而供硼显著降低Al在根细胞壁和细胞间隙的积累，缓解Al对根细胞质膜的损伤。 硼铝对豌豆根尖活性氧的影响：利用 Dihydroethidium（DHE）定位超氧阴离子（O2·-）、dihydrogen Rhodamine 123（DHR123）和luminol定位胞外过氧化氢（H2O2）、3’-p-(hydroxyphenyl) fluorescein（HPF）定位羟自由基（?OH）、CM-H2DCFDA定位胞内H2O2，对整根和过渡区不同种类ROS进行染色。结果表明ROS主要分布在质外体空间，尤其是细胞连接处，与桑色素标记的Al3+的空间分布相似。此外，我们还发现 O2·-主要聚集在分生区，而?OH和 H2O2主要在过渡区积累；但在-B和Al处理下它们的变化均主要发生在过渡区，在-B条件下，Al诱导过渡区质外体空间和细胞连接处的?OH和H2O2显著增加，胞内O2·-和 H2O2显著降低。而供硼可以有效缓解由铝诱导的 H2O2的改变，维持根尖过渡区ROS平衡。 硼铝对过渡区抗氧化酶分布和活性的影响：对豌豆侧根过渡区横切并利用抗体标记ROS产生和代谢酶（呼吸爆发酶RBOHD、超氧化物歧化酶SOD）、ROS清除酶（过氧化氢酶CAT、过氧化物酶POD）、AsA-GSH循环相关酶（抗坏血酸氧化酶 AO、单脱氢抗坏血酸还原酶 MDAR1、脱氢抗坏血酸还原酶DHAR1 和谷胱甘肽还原酶 GR）的分布。结果表明：以上蛋白主要分布在表皮和外皮层的细胞膜、质外体空间和细胞连接处，与 ROS分布一致。酶活测定结果表明 Al 处理显著提高了根尖过渡区 SOD、CAT、GR、APX、MDHAR、DHAR、G6PDH活性和 RBOH蛋白含量，而供硼后 SOD、GR、DHAR活性和RBOH蛋白含量均显著降低，CAT、APX、MDHAR和G6PDH活性显著增大， POD无显著差异。 硼铝对过渡区抗氧化剂的影响：与-Al相比，Al处理后 NADPH和 NADP+含量显著提高， AsA/DHA 显著降低。与-B+Al 相比，+B+Al 后 NADPH 和NADP+含量显著降低，AsA/DHA 显著增大。而其他抗氧化剂如类胡萝卜素、GSH和GSSG在各处理下无显著差异。 硼铝对过渡区抗氧化相关基因表达的影响：利用qPCR对豌豆过渡区CuZn-SOD、Fe-SOD、CAT、GR-1 和 Mn-SOD 基因表达水平进行分析，结果表明:与+B相比，-B和Al处理下CuZn-SOD、Fe-SOD、CAT和GR-1表达水平均显著上调。与-B+Al相比，+B+Al处理显著下调CuZn-SOD、CAT和GR-1表达水平并显著上调了 Fe-SOD表达水平，各处理下 Mn-SOD表达水平无显著差异。 综上，-B和 Al处理均抑制豌豆侧根的生长并造成过渡区 ROS大量积累。此外，铝、ROS 和相关酶分布一致，即主要分布在细胞膜、质外体空间和细胞连接处，表明胁迫下根尖过渡区ROS失衡的原因可能是铝毒导致ROS相关酶活性变化引起。而硼主要通过增加CAT、APX、MDHAR和G6PDH酶的活性、降低 SOD、GR、DHAR酶活性和 RBOH、AsA、DHA、NADPH、NADP+的含量、以及下调CuZn-SOD、CAT和GR-1基因的表达水平，并上调Fe-SOD的表达水平，从而缓解铝诱导的细胞内外ROS失衡和豌豆根系生长的抑制。
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