摘要
D-手性肌醇（D-chiro-inositol,DCI）是九种肌醇同分异构体的一种，它可作为胰岛素类似物而增强胰岛素敏感性，能够参与缓解并治疗由Ⅱ型糖尿病及多囊卵巢综合征引起的代谢紊乱。本课题对谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）进行代谢工程改造，旨在在C.glutamicum中构建DCI从头合成路径，具体研究内容如下。 1、阻断肌醇的分解代谢。C.glutamicum SN01中存在与肌醇分解代谢相关的基因，这些基因集中分布在基因簇iol1和iol2中。因此，首先敲除了这两个基因簇中除肌醇脱氢酶基因iolG和oxiD以外的所有基因，构建了底盘菌株DCI-01，并对底盘菌株DCI-01的生长以及肌醇的利用情况进行了检验。结果显示，当以肌-肌醇（myo-inositol,MI）作为单一碳源时，SN01可以生长并消耗MI，而DCI-01在培养过程中OD562几乎未发生变化，且没有检测到MI的消耗和DCI的产生，表明底盘菌株DCI-01的肌醇分解代谢被阻断。 2、探究肌糖异构酶对DCI合成的影响。在添加前体MI的条件下，分别表达四种不同的异源肌糖异构酶IolIn（n=1、2、3、4）来探索从MI到DCI的转化效率。结果显示，四株表达菌均产生DCI，其中IolI2的DCI产量最高，为2.41g·L-1。在此基础上通过IolIn与IolG的共表达进一步提升转化效率。结果显示，IolIn-IolG共表达后，DCI的产量均提高，其中IolI2-IolG的DCI产量提高到3.21g·L-1，IolI1-IolG、IolI3-IolG和IolI4-IolG分别为2.52、2.39和2.40g·L-1。此外，又将三个内源肌糖异构酶与IolG共表达，但DCI产量（2.66、0.41和0.16g·L-1）均低于IolI2-IolG。 3、改造前体MI合成途径。通过路径中肌醇磷酸合酶（IPS和Ino1）和肌醇单磷酸酶（IMP）的表达，旨在使细胞自主积累MI，为DCI的合成提供前体。首先，单独表达肌醇磷酸合酶，并对比了酿酒酵母来源的ScIPS和SN01内源的Ino1对MI合成的影响。结果显示，Ino1表达菌的MI产量为0.99g·L-1，而ScIPS表达菌的产量为0.79g·L-1。在此基础上，共表达大肠杆菌来源的肌醇单磷酸酶EcIMP，以期增加MI的产量，但MI的产量并没有增加。 4、利用Esa群体感应系统动态调控MI的前体葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）的竞争途径。为了使G-6-P流向MI合成途径，利用群体感应下调型启动子PesaS对糖酵解途径中的磷酸葡萄糖异构酶基因pgi和磷酸戊糖途径中的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf进行动态下调。结果显示，pgi的动态下调使得MI产量从0.99g·L-1提升至2.33g·L-1，同时动态下调pgi和zwf使得MI产量进一步提升至2.91g·L-1。 5、基于上述研究，将DCI转化时产量最高的肌糖异构酶和肌醇脱氢酶共表达组合IolI2-IolG与MI合成时产量最高的肌糖磷酸合酶Ino1进行共表达，转化到PesaS-pgi PesaS-zwf动态调控菌株中，构建了DCI从头合成菌株DQ-06。发酵72h后，DQ-06的DCI产量为1.00g·L-1。 综上所述，我们在谷氨酸棒杆菌中成功构建并实现了DCI的从头合成。
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