摘要
黄曲霉毒素B1（AFB1）是I级致癌物，主要危害人和动物的肝脏、肾脏，具有强烈的致癌、致畸性和致突变性。因此，开发快速、低成本、简便的AFB1检测新方法，意义重大。近年来，基于DNA模板化银纳米簇（AgNCs-DNA）因其优异的荧光性质、良好的生物相容性、无需额外标记等特性，在荧光生物传感领域展现出巨大的应用潜力。本文以AgNCs-DNA为免标记荧光探针，核酸适配体（Apt）为分子识别元件，通过耦合荧光能量共振转移（FRET）、变色龙DNA序列和富G荧光增强子等多种策略，成功构建了一系列荧光生物传感器，实现了对AFB1的灵敏检测或早期筛查。具体研究内容如下： 1、以设计的6条DNA链为模版，以AgNO3为前驱体，NaBH4为还原剂，一锅法制备了AgNCs-DNA免标记系列探针。比较六种DNA模板合成的AgNCs-DNA的荧光性质，选择荧光性质最优异的AgNCs-DNA为荧光探针与AFB1的Apt复合，以MoS2纳米片为淬灭剂，成功构建了组件式通用型FRET适配体传感器。采用透射电镜（TEM）、荧光光谱等多种手段，对所制备的AgNCs-DNA及传感器构建过程进行了表征。优化条件下，AFB1浓度与传感体系的荧光信号强度呈现良好的线性关系，线性回归方程为 I=2.68cAFB1+20.84 （R2=0.9981），线性区间为 0.03-120 ng/mL，检出限（LOD）为 3.63 pg/mL（S/N=3）。通过将传感器中的AFB1的Apt更换为赭曲霉毒素A（OTA）或赭曲霉毒素（ZEN）的Apt，成功实现了对OTA或ZEN的识别与检测，验证了该传感器的通用特性，为食品安全监测、环境污染物检测、生物医学诊断等领域提供了新的思路。 2、以设计的DNA链为模版，AgNO3为前驱体，NaBH4为还原剂，一锅法合成了发射绿色荧光的AgNCs-DNA免标记探针。该探针利用模板上预留的杂化区域与设计的G7-Apt序列进行配对，形成独特的比率荧光传感体系。G7-Apt序列不仅含有Apt用于识别目标分子 AFB1，还包含富 G 碱基序列作为荧光增强子和转换子，能够将原本发射绿色荧光的AgNCs-DNA转换为发射红色荧光的AgNCs-DNA/G7-Apt探针。当目标物AFB1存在时，会与G7-Apt上的Apt部分结合，形成G7-Apt/AFB1复合物，导致G7-Apt与AgNCs-DNA分离，从而引起传感器中绿色荧光和红色荧光比值变化，基于此构建了一种新型比率荧光适配体传感器，用于AFB1灵敏检测。采用TEM、荧光光谱等多种手段，对所制备的AgNCs-DNA和传感器构建过程进行了表征。优化条件下，I560/I625与AFB1浓度之间呈现良好的线性关系，线性回归方程为 lg(I560/I625)=0.089+0.278lgcAFB1（R2=0.9973），线性区间为 0.005-400 ng/mL，LOD 低至 1.64 pg/mL（S/N=3）。同时，该比率荧光传感器在 30-400 ng/mL 的浓度范围内，表现出显著的裸眼可视化荧光颜色变化，为AFB1的现场直观检测提供了便利。所构建的比率荧光传感器仅使用了AgNCs作为单一荧光探针，无需借助其他荧光淬灭剂，从而简化了传感器的制备过程并显著降低了检测成本，具有广阔的应用前景。 3、以设计的发夹DNA1（hDNA1）为模版，AgNO3为前驱体，NaBH4为还原剂，一锅法合成了弱荧光发射的AgNCs-hDNA1免标记探针。利用富G序列发夹DNA2（hDNA2）对AgNCs-hDNA1荧光信号的增强能力，借助催化发夹自组装（CHA）触发的DNA链置换循环机制，构建了一种用于检测AFB1生物合成关键基因alfD的“点亮型”荧光DNA传感器。在目标aflD基因（T-DNA）存在时，CHA过程被激活，AgNCs-hDNA1的茎环结构展开，导致其与T-DNA形成杂交双链（AgNCs-hDNA1/T-DNA）。随后，该杂交双链与hDNA2再次进行催化组装，将T-DNA从杂交双链中替换下来，形成AgNCs-hDNA1/hDNA2复合物。替换下的T-DNA进入新一轮CHA循环，从而实现信号放大。由于hDNA2的5’端是富含G碱基的，所以AgNCs-hDNA1/hDNA2形成的同时，AgNCs的荧光信号被增强，从而实现“点亮”效果。采用 TEM、荧光光谱等多种手段，对所制备的 AgNCs- hDNA1 和传感器构建过程进行了表征。优化条件下，传感体系的荧光强度与产毒基因aflD浓度之间呈现出良好的线性关系，线性回归方程为 I=167.76lgcaflD+459.19（R2=0.9941），LOD 为 1.73 pM （S/N=3）。该传感器为农产品AFB1污染的早期筛查提供了新的侦检工具。
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