摘要
L-肌肽（L-Carnosine）是由β-丙氨酸（Beta-alanine）和组氨酸（Histidine）通过肽键连接而成的二肽。作为一种天然二肽，L-肌肽具备的生理特性，使其广泛应用于食品、美容及医药等行业。生物合成法相比于化学合成法更为温和、高效，虽然有关生物法合成 L-肌肽的研究已有报道，但 L-肌肽的产率和转化率较低，不能满足工业化生产的要求。本研究以来源于粘质沙雷氏菌的二肽酶（Dipeptidase, SmPepD）为出发点，结合蛋白质工程和转运体工程的策略，构建出高效合成 L-肌肽的大肠杆菌细胞工厂，在 5 L发酵罐中成功提升了 L-肌肽的生产效率。主要研究结果如下： （1）筛选优质的 L-肌肽全细胞催化剂。通过前人研究及序列比对，在大肠杆菌中异源表达了四种不同来源的二肽酶，测定其酶学性质以及转化能力。结果表明，E. coli BL21/pET28a-SmpepD 的比酶活最高，为 118.2±3.2 U·mg-1。全细胞转化后，E. coli BL21/pET28a-SmpepD的 L-肌肽产量为 8.4 g·L-1，是 E. coli BL21/pET28a-EcpepD的 4.2倍。 （2）采用蛋白质工程策略对合成L-肌肽的关键酶进行改造。通过对SmPepD进行蛋白质三维结构的构建及计算机模拟分析，经过定点及多点组合突变后，获得了一株酶活性相较于野生型提高了41.6%的双突变体酶SmPepDT168S/G148D（M26）。该突变体展现出了优秀的催化效能，是生产L-肌肽的优选催化剂。 （3）深入探究了野生型酶和突变体酶M26的分子动力学参数，并对二者进行了分子动力学模拟。结果显示，突变体酶M26对底物β-丙氨酸的Km值相较于野生型酶降低了220%，而kcat/Km值则提高了210%。此外，突变体酶M26的RMSF高于野生型，这也证明了突变体酶M26的蛋白结合口袋处的柔韧性增加，所以提高了突变体酶M26的催化效率。 （4）利用转运体工程构建生产L-肌肽重组菌株。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，对大肠杆菌E. coli BL21的基因组进行操作，敲除编码组氨酸外排蛋白的基因 yeaS。构建了 E. coli BL21/pET28a-SmpepD-M26-ΔyeaS，与 E. coli BL21/pET28a-SmpepD-M26相比，L-肌肽的产量提高了 48.3%。与此同时，测定胞内外组氨酸的含量，发现 E. coli BL21/pET28a-SmpepD-M26-ΔyeaS 的胞内组氨酸含量最高，说明敲除 yeaS 直接导致细胞内组氨酸积累，使得反应能够加速进行，从而增加L-肌肽的累积。 （5）L-肌肽生产体系的优化及放大生产。为了进一步提高 L-肌肽的产量，对重组菌株 E. coli BL21/pET28a-SmpepD-M26-ΔyeaS的转化条件如温度、菌体量、底物添加比例及金属离子浓度进行优化，确定最佳转化条件。最后，在 1.5 L体系中转化 48 h，生成了 29.1±2.3 g·L-1的 L-肌肽，组氨酸的摩尔转化率为 49.3%，产量较原始菌株 E. coli BL21/pET28a-SmpepD提高了342.0%。
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