摘要
目的： 创面愈合修复过程中任何紊乱及内外环境刺激导致的慢性伤口，甚至迁延不愈，给临床治疗及患者带来重大负担。目前的治疗干预措施在促进伤口愈合方面效果有限。外源性电刺激治疗被提出作为加速伤口愈合的有效替代方法，能够模拟创面自然愈合机制，加速皮肤再生，同时限制与传统治疗相关的不良反应。本研究创新性开发氨基化修饰石墨烯量子点联合小细胞外囊泡(amination modified graphene quantum dots and small extracellular vesicles，NH2-GQDs@sEVs)导电水凝胶复合体系，评价其促进创面愈合效果及生物安全性，揭示其修复创面的具体分子机制，为创面愈合，特别是难愈性创面修复提供新的思路，为实现主动干预多模式可穿戴设备打下基础。 方法： 1.采用紫外光谱、荧光光谱和傅里叶红外光谱(fourier transform infrared spectroscopy ， FT-IR )测试分析未修饰石墨烯量子点(unmodified graphene quantum dots，UGQDs)和NH2-GQDs的光学性能。采用高倍透射电镜(high power transmission electron microscopy，HTEM)和原子力显微镜(atomic force microscope，AFM)观察UGQDs和NH2-GQDs的结构大小。采用westernblot、细胞免疫荧光和qRT-PCR检测不同GQDs能否影响巨噬细胞及成纤维细胞(dermal fibroblasts，DFs)增殖和迁移能力，探究不同GQDs对巨噬细胞极化相关蛋白的影响。采用稀释涂布平板法比较不同GQDs对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌效果。 2.采用甲基丙烯酰化明胶(gelatin methacryloyl，GelMA)作为基底，通过紫外光交联将GQDs掺杂在GelMA网络中，形成导电水凝胶。采用电化学阻抗谱测试比较不同GQDs导电水凝胶导电性能，选取最适导电介质。扫描电镜下观察GQDs导电凝胶孔隙结构，采用溶胀实验、降解实验、压缩实验和拉伸实验对导电凝胶进行表征。 3.在大鼠背部建立一个圆形的全层皮肤损伤模型(直径2cm)，在创面原位注射光交联导电凝胶后，连接电极片，每天电刺激1h，治疗周期为2天1次。探究GQDs导电凝胶在外源性电刺激作用下的创面治疗效果，并比较低电压组和高电压组的治疗效果。HE染色观察皮肤组织结构，免疫组化染色检测增殖和新生血管指标PCNA和CD31，天狼星红染色检测胶原重排，综合评价GQDs导电凝胶复合体系的治疗作用。 4.自主设计一种能够实现六孔板内电刺激的细胞培养装置，体外采用划痕实验检测不同电压处理DFs后对其迁移能力的影响，CCK8检测不同电压处理DFs后对其增殖能力的影响，细胞免疫荧光检测不同电压处理DFs后对其胶原生成能力的影响。通过测序技术探索GQDs联合电刺激治疗后促进创面愈合的具体机制，采用细胞免疫荧光、westernblot和组织免疫荧光在体内外进行验证。 5.采用超速离心法制备hucMSC-sEVs并进行鉴定。采用孵育法制备GQDs@sEVs导电水凝胶并对其进行表征。采用划痕实验、CCK8、westernblot、细胞免疫荧光和血管形成实验探究GQDs@sEVs导电水凝胶及其介导电刺激对DFs、血管内皮细胞和神经细胞生物学功能的影响。构建GK大鼠糖尿病创面模型，探究GQDs@sEVs导电水凝胶在电刺激作用下对糖尿病创面的治疗效果，通过HE染色观察皮肤组织结构，免疫组化染色检测增殖和新生血管指标PCNA和CD31，天狼星红染色检测胶原重排。 结果： 1.UGQDs和NH2-GQDs在紫外区有强吸收并可延伸至可见光，荧光光谱表明UGQDs和NH2-GQDs通过单一激发光源激发可得到不同发射波长的荧光，实现一元激发，多元发射，其荧光强度随着稀释浓度的变化而变化。FT-IR表明NH2-GQDs主要峰值的光谱为N-H(1560cm-1)和C-N(809cm-1)，以上符合GQDs的光学性能。HTEM和AFM观察到NH2-GQDs的大小在10nm左右，厚度在1nm左右。Transwell实验结果表明NH2-GQDs能够明显促进DFs迁移。 在LPS诱导的炎症模型中，NH2-GQDs具有一定的免疫调控作用并且能够促进RAW264.7细胞的增殖。稀释涂布平板实验表明NH2-GQDs显著抑制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌耐药菌株的生长。 2.通过紫外光交联将NH2-GQDs掺杂在GelMA网络中，随着NH2-GQDs的加入，GelMA凝胶由白色变成棕色，表明NH2-GQDs在GelMA中成功掺杂。电化学阻抗谱测试表明NH2-GQDs导电凝胶具有更好的电性能，我们最终选择NH2-GQDs作为导电介质。FT-IR表明NH2-GQDs导电凝胶表现出酰胺带特征，扫描电镜结果显示NH2-GQDs导电凝胶具有均匀的大孔结构，具有通过吸收伤口渗出物来促进伤口愈合的潜力，溶胀实验、降解实验结果表明NH2-GQDs导电凝胶具有稳定的溶胀率和降解率。压缩实验表明，NH2-GQDs的加入并不影响GelMA凝胶的抗压性能，压力都在0.1Mpa左右。但NH2-GQDs的加入能够使GelMA凝胶的最大拉力提升至0.23Mpa，表明NH2-GQDs导电凝胶具有良好的抗拉能力。 3.在体内模型中，NH2-GQDs导电水凝胶能有效加速创面愈合，缩小创面面积，且3V的治疗效果最好。HE染色结果显示高电压治疗组在2周时明显促进皮肤及其附属器件再生，且创面明显减小，而其他组别还存在创面较大，炎性细胞浸润，皮下纤维组织排列紊乱，染色结果表明高电压治疗组能够明显促进PCNA和CD31的表达增加以及胶原生成增多。 4.在体外细胞导电装置模型中，1V刺激组与其他组别相比，更有利于促进DFs的迁移和增殖能力。细胞免疫荧光结果显示1V刺激组能够更好的促进collagenI的生成。测序结果表明，NH2-GQDs联合电刺激之后存在80个显著下调差异基因，且下调基因主要富集在“extracellularspace/extracellularregionpart/extracellularregion/extracellularmatrixcomponent/extracellularmatrix”词条中，与此同时，差异基因聚类热图中存在MMP14显著降低。Westernblot、细胞免疫荧光和免疫组化染色结果表明NH2-GQDs联合电刺激后能够明显降低MMP14蛋白的表达。 5.超速离心法成功提取hucMSC-sEVs，透射电镜观察显示hucMSC-sEVs呈双凹圆盘状，纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analyzer，NTA)结果表明hucMSC-sEVs的粒径在150nm左右。Westernblot结果表明hucMSC-sEVs稳定表达CD9、CD63、HSP70、TSG101、Alix而不表达Calnexin。凝胶表征结果显示，sEVs加入不影响NH2-GQDs导电凝胶的性能。荧光染色结果表明sEVs的成功掺杂。BCA结果表明，NH2-GQDs@sEVs凝胶体系存在7天左右的缓释性能。体外实验表明，NH2-GQDs联合sEVs及电刺激后促进晚期糖基化终末产物修饰的牛血清白蛋白(bovine serum albumin modified with advanced glycosylation end products，AGEs)损伤DFs后的增殖，迁移及胶原生成能力，神经细胞(pheochromocytoma cells ， PC12 )增殖能力以及人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)的血管生成能力。体内实验表明，sEVs的加入能够进一步促进糖尿病大鼠创面愈合。从组织层面看，NH2-GQDs@sEVs导电凝胶体系联合电刺激治疗组表皮再生化已完成，皮肤组织结构完整，层次分明并伴随皮肤附属腺体的生成。 结论： 本研究设计合成NH2-GQDs@sEVs导电凝胶全新修复体系。阐明NH2-GQDs@sEVs导电凝胶体系可通过免疫调控、抑制耐药菌生长和抑制MMP14通路促进不同类型创面修复，具有较好的有效性和动物体内应用安全性，为创面治疗提供新的思路和方法。
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