摘要
稀有人参皂苷Rg3在抗炎、免疫调节和抗肿瘤等方面具有重要的生理功能，被广泛应用于相关疾病的治疗中。Rg3是Rh2的糖基化衍生物，两者均属于原人参二醇（PPD）型人参皂苷。PPD在其C3位的羟基被糖基化生成Rh2，继而Rh2的C3位上的糖基可进一步被糖基化为Rg3。从PPD到Rg3的转化合成由 UDP-糖基转移酶（UGT）催化。已报的酵母（Saccharomyces cerevisiae）来源糖基转移酶突变体 UGT51m 和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）来源糖基转移酶突变体 Bs-YjiCm 都能将 PPD 高效转化为 Rh2。已知催化 Rh2 生成 Rg3的UGT 不多，如人参（Panax ginseng）来源的 UGTPg29。此外，蔗糖合酶（SuSy）通常被用于与UGT偶联，以循环再生糖基供体尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）。常用的 SuSy 包括拟南芥（Arabidopsis thaliana）来源 AtSuSy 和绿藻（Micractinium conductrix）来源 McSuSy 突变酶 S31D 等。本论文旨在构建将PPD转化合成为人参皂苷Rg3的UGT-SuSy级联反应体系，解决反应过程中的关键问题，并进行反应过程优化，以实现Rg3的高效合成。主要研究结果如下： （1）初步建立并比较不同 UGT-SuSy 级联反应。首先在不同的表达载体pETDuet-1和pRSFDuet-1上构建UGT51m/UGTPg29和McSuSy/AtSuSy双酶共表达体系，实现 S31D-Pg29-pET 和 S31D-51m-pRSF 的组合，S31D-Pg29-pRSF和S31D-51m-pET的组合，At-Pg29-pET和At-51m-pRSF的组合，At-Pg29-pRSF和At-51m-pET的组合。用所得到的工程菌株产酶，构建级联反应。实验结果表明，将UGTPg29构建于pETDuet-1载体上，UGT51m构建于pRSFDuet-1载体上时两UGT表达较好；在所研究的两个SuSy中，AtSuSy的酶活力和催化效率都优于S31D；比较不同产酶方式，发现两菌三酶体系中Rg3产量是一菌三酶的1.58倍。此外，由于糖基转移酶UGT51m催化效率较低，选择用Bs-YjiC代替UGT51m，并对糖基转移酶 Bs-YjiCm 进一步突变。在 37℃ 和 10% DMSO 的条件下，投入6 mM的底物PPD，含有Bs-YjiCm突变体N178I的反应中Rh2浓度在6 h 后达到最高（4.8 mM），是 Bs-YjiCm的 2.8 倍，UGT51m 的 1.21 倍。该突变体在37℃ 和 10% DMSO 条件下具有良好的稳定性。 （2）改善糖基转移酶UGTPg29的稳定性。基于在线网站Fireprot、Hotspot的预测结果，分析比较突变点的能量变化，再运用深度学习的方法预测这些突变酶对于底物 Rh2 的 Km与 Kcat 值，并以 Kcat/Km值排序，挑选出该值高于UGTPg29 （ WT ）的突变体。进一步参考突变酶与底物复合物模型的结合能（Affinity），最终挑选出 R91M、D184M、A287V、A342L 四个突变位点，进行单点及组合突变实验，构建工程菌株，诱导表达并获得重组酶。比较上述突变酶与 WT 的稳定性，以及用于催化反应时的 Rg3 产率，结果表明， R91M/D184M/A287V/A342L这一组合突变体可以较快速度持续积累Rg3，优于WT及其他突变体。 （3）“一锅”三酶高效转化PPD生成Rg3。用上述UGTPg29的四点突变体、 Bs-YjiCm 的 N178I 突变体和 AtSuSy 一起建立级联催化反应，对其中的两种 UGT 的比例和浓度、反应 pH 值以及 UDP、蔗糖（Suc）和 DMSO 的浓度进行了优化。优化后的反应体系包括：6 mM PPD 、15%（v:v）DMSO、2% Tween-80、2 mM UDP、300 mM Suc、90 mU/mL 的 N178I 和 810 mU/mL 的R91M/D184M/A287V/A342L，用 50 mM Tris-HCl 缓冲溶液（pH 7.5）补齐至 5 mL。在此基础上，采用分批补料策略，在 3 h、6 h 时分别补加 6 mM PPD，反应24 h 后生成 12.38 mM （9.72 g/L）Rg3，产率为 68.78%。
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