摘要
睾酮（Testosterone，T）是人体中一种重要的雄性激素，在促进蛋白合成、维持肌肉强度等方面具有重要作用。其可以作为C19类固醇药物中间体，应用于多种类固醇药物的合成。17β-羟基类固醇脱氢酶为 NAD(P)(H)依赖性酶，能够催化甾体化合物 C-17羰基与羟基之间的相互转化。利用 17β-羟基类固醇脱氢酶转化雄烯二酮（Androstenedione，AD）生产睾酮的微生物转化法具有高效性、高立体选择性和反应条件温和等优势，但仍存在17β-羟基类固醇脱氢酶的催化活性较差、产物睾酮的合成效率偏低的问题。因此，本论文在大肠杆菌中异源表达真菌 Cochliobolus lunatus 来源的 17β-羟基类固醇脱氢酶（17β-HSDcl），通过对该酶进行分子改造，获得催化性能提升的重组菌，并初步解析关键残基对17β-HSDcl催化活性的影响。在此基础上，优化重组菌生产睾酮的工艺条件，进一步提高睾酮的合成浓度和产物摩尔得率。主要研究结果如下： （1）17β-羟基类固醇脱氢酶的异源表达及酶学性质研究。采用全基因合成法克隆了真菌Cochliobolus lunatus 来源的 17β-羟基类固醇脱氢酶，在大肠杆菌 BL21(DE3)中进行异源表达。经SDS-PAGE 和 Western Blot 验证表明该重组酶实现了可溶性表达。进一步应用液相-质谱联用（LC-MS）方法考察了该酶对底物雄烯二酮的转化情况，结果表明该酶可以转化雄烯二酮生成睾酮。继而对该酶开展了分离纯化和酶学性质研究，确定了17β-HSDcl的最适反应温度为25℃，最适反应pH为7.5，金属离子Ba+能够明显促进该酶活性。该酶对C17羰基类甾体化合物具有催化作用，相对底物雄烯二酮的Km、kcat和kcat/Km值分别为0.256 mmol/L、4.970 /min 和 19.414 L/(mmol·min)。 （2）17β-羟基类固醇脱氢酶的半理性设计改造。基于结构分析，首先对控制蛋白构象开关的氨基酸残基位点H164和Y212进行了单点饱和突变，通过微生物转化法验证了突变体的催化能力。产物浓度检测结果表明，突变体 H164V 的催化性能最优，合成的睾酮浓度较出发菌株提高了 124.2%。以重组菌 BL21(DE3)-17β-HSDclH164V为研究对象，通过丙氨酸扫描进一步筛选得到了5个位于活性口袋附近的关键氨基酸残基F109、T151、N154、V161和S209，并对其进行了二重饱和突变。微生物转化结果表明，当底物投料浓度为 0.3 g/L 时，二重突变体 H164V/T151A 转化生成的睾酮浓度提高到 69.74 mg/L，较单突变体H164V提高了26.1%。通过比较突变体H164V和H164V/T151A与野生型17β-HSDcl的分子动力学参数发现，突变体H164V和H164V/T151A对雄烯二酮的kcat/Km值分别为野生型的5.2倍和37.6倍。基于半理性设计获得的突变数据，初步解析了关键氨基酸残基发挥的作用。结果表明，164位组氨酸及151位苏氨酸突变为疏水性氨基酸，更有利于疏水性底物雄烯二酮的催化；增加有利相互作用或减少不利相互作用、缩小活性口袋及减小O 底物-OHY167之间的距离能够促进催化反应的进行。 （3）重组菌 BL21(DE3)-17β-HSDclH164V/T151A合成睾酮的工艺优化。利用单因素实验确定了微生物转化的最适培养基组分为：胰蛋白胨 32 g/L，酵母提取物 20 g/L，NaCl 5 g/L。最适转化条件为：培养温度25℃，培养基初始 pH 7.0。在以上转化条件下，当底物投料浓度为 0.5 g/L 时，重组菌 BL21(DE3)-17β-HSDclH164V/T151A转化生成睾酮的浓度为 148.15 mg/L，产物摩尔得率为 29.4%。为提高底物雄烯二酮的溶解性，从而提高产物睾酮的合成浓度，进一步优化了助溶剂的种类及添加浓度。结果表明，当添加16%（v/v）的 DMSO 时，产物睾酮的浓度最高为286.62 mg/L，较对照提高了 297.4%。底物投料浓度优化研究表明，当底物投料浓度为 0.6 g/L 时，重组菌 BL21(DE3)-17β-HSDclH164V/T151A合成的睾酮浓度最高为 444.50 mg/L，产物摩尔得率达到 73.6%。
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