摘要
解脂亚洛酵母(Yarrowia lipolytica)是目前应用最为广泛的非常规酵母，被用于各类化学品、燃料和天然产物的生产。解脂亚洛酵母可以高效利用多种常见碳源，具有生长快、营养要求低，具备糖基化、功能性表达 P450酶等优点，有极大的开发价值和广泛的工业应用前景。然而一直以来，解脂亚洛酵母同源重组效率低，缺乏成熟的基因编辑工具和多基因合成途径组装工具，限制了其在合成生物学领域的应用。L-酪氨酸衍生物包括苯丙烷、酚酸、芪类、黄酮以及生物碱等，拥有万亿级规模的市场。目前这些化合物的主要来源是从植物中提取，存在着周期长环境影响大等问题。因此，利用微生物合成 L-酪氨酸衍生物具有巨大的优势。本论文以解脂亚洛酵母合成 L-酪氨酸衍生物过程为研究对象，强化了解脂亚洛酵母同源重组系统，开发了能够高效整合外源长途径的多拷贝合成生物学工具，实现了多种 L-酪氨酸衍生物的高水平异源合成。具体工作内容包括： (1) 重塑解脂亚洛酵母同源重组系统实现高效率同源重组。在解脂亚洛酵母中建立Cas9 系统，重新设计和优化解脂亚洛酵母的同源重组系统，使工程菌株的同源重组效率提高 56 倍以上，可以实现短至 50 bp 同源臂的同源重组。将 hB27 序列与 Cas9 的 C端融合表达，以募集更多的 Rad51 修复蛋白，500 bp 同源臂的整合效率提高到 78%。进一步突变Cas9，TB-Cas9(Cas9F539S-E1007L)整合效率提高到85%，3位点和4位点的整合效率分别高达 25%和 10%。利用这种高效的工具和工程菌株，对不同染色体上的中性位点进行了表征，获得了40个高整合和高水平表达的位点。 (2) 开发高效可重复使用的多拷贝和高拷贝整合工具。利用逆转录转座子和 rDNA序列的长末端重复序列(LTRs)的序列多样性，将 YLT1?YLT4和 26S rDNA以及 6个筛选标签(HphMX、NatMX、BleMX、TRP、URA3和 LEU2)组合构建，使用绿色荧光蛋白(HrGFP)报告系统构建和评估了一组 30 个质粒包的多拷贝整合位点的可回收载体YaliCMulti。此外，对现有氨基酸标签的密码子进行负优化，在蛋白序列的C端融合降解信号肽，并替换启动子为弱启动子(PLEU2)，获得了 20 个高效整合的质粒载体YaliHMulti，HrGFP的荧光强度相比于YaliCMulti提高了2-5倍。为了验证这些工具的通用性，利用 YaliCMulti 和 YaliHMulti 分别整合 9.8 Kb 和 20 Kb 的(2S)-柚皮素合成路径，5 L发酵罐中(2S)-柚皮素产量达到 8.3 g/L，是迄今为止公开报道的最高产量。 (3) 实现了 L-酪氨酸衍生物白藜芦醇的高水平合成。为了验证工具的可用性以及解脂亚洛酵母作为 L-酪氨酸衍生物细胞工厂的优势，选择途径相对简单的 L-酪氨酸衍生物白藜芦醇作为目标化合物验证。通过筛选不同的白藜芦醇合成路径基因，表达FjTAL、Pc4CL1和VvSTS的组合获得了最佳的白藜芦醇产量。随后工程化改造莽草酸途径，将Pc4CL1和VvSTS的模块化酶组装，增强对香豆酸供应并将糖酵解通量转向4-磷酸赤藓糖，白藜芦醇产量达到 235.1 mg/L。进一步增加丙二酰辅酶 A 的供应并将关键途径基因进行两轮多拷贝整合，白藜芦醇产量提高到 819.1 mg/L。通过在 5 L发酵罐上进行分批补料工艺优化，白藜芦醇产量达到22.5 g/L，葡萄糖产率为65.5 mg/g，均为公开报道的最高水平。表明了解脂亚洛酵母作为L-酪氨酸衍生物的细胞工厂的潜力。 (4) 复杂 L-酪氨酸衍生物小檗碱合成路径的挖掘和合成。首先以富含生物碱的植物汉防己为研究对象，检测其不同组织中各类生物碱含量。然后通过全长转录组测序，对 Unigenes 差异基因表达分析，绘制了汉防己中几种主要生物碱的合成路径，并根据每个组织中基因的 FPKM 值差异绘制了不同生物碱合成路径基因图谱。根据推测的汉防己中小檗碱的合成路径，添加前体 L-酪氨酸和多巴胺的条件下，在解脂亚洛酵母中验证了小檗碱合成路径基因。随后，将小檗碱合成路径基因分模块整合到前体 L-酪氨酸强化的解脂亚洛酵母中，实现了(S)-去甲乌药碱、(S)-牛心果碱和小檗碱的从头生物合成。最终通过代谢重构、鉴定合成步骤限速酶、敲除下游氧化还原途径基因强化前体 L-dopamine和 4HPAA的供给，显著提升了(S)-去甲乌药碱(12.1 mg/L)、(S)-牛心果碱(4.2 mg/L)和小檗碱(0.8 mg/L)的从头合成产量，系统验证了开发的工具在构建复杂代谢途径中的应用，为其他非常规酵母的开发提供了借鉴。
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