摘要
花生是我国重要的油料作物和经济作物，在保障农业发展与粮食安全方面具有重要作用。目前，黄曲霉毒素（AF）污染是影响我国花生产业发展的主要因素之一，其中尤以黄曲霉毒素B1 （ AFB1 ）毒性强、污染范围广，发展可实现花生“耕-种-管-收”全流程AFB1检测的方法利于从源头上监测AF污染问题。相比于依赖“现场采样-实验室检测”的AFB1分析技术，电化学法仪器简单、响应速度快且成本低，但由于农业环境多变、样本基质复杂等因素干扰分析结果、影响检测效率，发展精准、灵敏、便携的电化学传感器仍是AFB1电化学法检测的主要难题。针对以上问题，本论文发展了多种比率电化学适配体传感器的构筑方法，提出了基于光响应机制的传感器信号放大策略，构建了水凝胶基光响应比率电化学传感器，并进一步研制了便携式电化学传感装置，实现了AFB1的精准、灵敏、现场分析，为花生及其种植土壤中AFB1的污染监测提供了新的解决方案。本论文的主要研究内容和研究结果如下： （1）为了提高传感器的精准度，以二茂铁标记AFB1适配体（Fc-Apt）单信号电化学传感器为基础，引入比率策略，构建了比率电化学适配体传感器，探究了AFB1的连续重复响应机制。其中，Fc-Apt为识别元件与响应信号（IFc），硫堇还原氧化石墨烯（THI-rGO）复合材料为参比信号（ITHI），根据ITHI、IFc比值（ITHI/IFc）与AFB1浓度关系实现精准分析。同时，基于比率策略可同时消除外界环境因素对两个响应信号的干扰，实现了比率传感器对花生样品中AFB1浓度范围为0.01~100 ng/mL的连续重复检测，回收率在88.0%~104.0%之间，并成功用于14天霉变实验花生样品中AFB1的监测。检测结果与高效液相色谱-荧光检测法（HPLC-FL）（GB 5009.22-2016）所得结果一致，表明传感器的准确性良好。 （ 2 ）为了实现传感器动态范围的调控，设计了基于亚甲基蓝标记茎环DNA （ MB-DNA）的双比率电化学适配体传感器，以茎环MB-DNA和线性Fc-Apt为响应探针（IMB， IFc），蒽醌还原氧化石墨烯（AQ-rGO）复合材料为参比探针（IAQ）。根据识别元件MB-DNA与Fc-Apt对AFB1的不同亲和力，实现了传感器在0.0001~500 ng/mL范围内对AFB1检测范围的调控。应用于花生样品中AFB1的检测，回收率在99.0%~111.7%之间。进一步，以引起电流IMB变化的AFB1固定浓度为传感器的阈值响应浓度，实现了传感器对7天霉变实验花生样品中AFB1的阴性/阳性判别分析。检测结果得到HPLC-FL验证。 （ 3 ）为了提高AFB1检测的灵敏度，引入光响应策略，构建了基于金纳米粒子（ AuNPs ）调控MB光响应的比率电化学适配体传感器。以AuNPs与MB标记互补DNA （MB-cDNA）为光响应探针构筑电化学传感界面，组装Fc-Apt与MB-cDNA形成双链DNA结构，使MB远离AuNPs，从而抑制了光激发下MB与AuNPs之间的能量转移。当Fc-Apt与AFB1识别后，Fc-Apt-AFB1从传感界面剥离，IFc降低，同时，MB-cDNA在传感界面发生弯曲，MB与AuNPs的距离变近，受AuNPs 表面等离子体共振（SPR）效应的影响，IMB增大。将光响应传感器的灵敏度与黑暗条件下进行对比，光响应传感器的灵敏度提高了2.3倍，对AFB1的浓度响应范围为0.5~1000 ng/mL，检出限低至0.467 ng/mL，并成功用于花生与土壤样品中AFB1的灵敏检测，回收率在86.3%~106.0%之间，且检测结果与HPLC-FL所得结果一致。 （4）为了提高激发光对传感界面的作用效率，引入单波长光响应策略，设计了基于单探针响应的比率电化学Janus生物传感界面。根据MB与AuNPs对不同激发光的响应能力不同，选择合适波长的光源。以532 nm激光为AuNPs的激发光、650 nm激光为MB的激发光，考察激发方向对传感界面响应电流的影响。当532 nm激光从传感界面正面激发，650 nm激光从背面激发时传感器的性能最佳。AFB1存在时，MB与电极表面的距离发生变化，引起响应信号I532 front和I650 back不同程度的降低，基于I532 front/I650 back与AFB1浓度关系，实现在AFB1浓度范围为0.0005~50 ng/mL的分析，检出限低至0.175 pg/mL，成功用于花生样品中AFB1的检测，回收率在92.0%~103.0%之间，超高效液相色谱-串联质谱法验证了Janus生物传感器的准确性良好。 （5）为了提高传感器的便携性，引入具有空间限域功能的水凝胶基质作为适配体与AFB1的识别场所，利用365 nm紫外光固定水凝胶基质于电极表面，构建了基于水凝胶的光响应比率电化学传感器。当AFB1存在时，水凝胶的多孔网状结构使AFB1被限制在水凝胶的3D基质液中，提高了适配体对AFB1的识别效率。由于水凝胶为负电性，所以水凝胶基质中负电性的Apt-AFB1和cDNA被排斥在水凝胶边缘，被释放的正电性MB分散在水凝胶孔状结构中，IMB增大。光激发下，基于AuNPs的SPR效应，IMB进一步增大。以溶液中[Fe(CN)6]3-/4-探针产生的电流（I[Fe(CN)6]3-/4-）为参比信号，IMB为响应信号，检测浓度响应范围为0.001~1000 ng/mL的AFB1，检出限低至0.8 pg/mL，实现了花生和土壤样品中AFB1的分析，回收率在75.8%~106.0%之间，HPLC-FL法对AFB1的检测结果验证传感器的准确性良好。 （6）为了实现传感器的现场快速分析，基于上述研究，结合空间限域水凝胶，引入便携性高、成本低的激光诱导石墨烯电极，研制了便携式电化学传感装置。该装置主要包括样品存储块96孔板、控制激光诱导石墨烯电极移动的电动滑轨、为光源供电的24 V锂电池、掌上恒电位仪和笔记本电脑。传感器构建时，引入MB-rGO复合材料为响应信号（IMB），I[Fe(CN)6]3-/4-为参比信号，光激发下，根据IMB/I[Fe(CN)6]3-/4-值与AFB1浓度关系，实现传感装置在AFB1浓度为0.1~500 ng/mL范围的分析，检出限低至0.019 ng/mL。将传感装置用于检测花生样品中的AFB1，回收率在81.0%~89.3%之间。最终，用于监测2021、2022和2023年花生收获前7天花生农田中AFB1的污染情况，满足了花生及其种植土壤中AFB1的现场检测需求。
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