摘要
目的： 1.回顾性分析糖尿病大血管病变患者的临床病例资料，研究其临床中医证型、证素分布特点，并探讨不同证型与多种相关因素的内在关系，探寻本病的证素分布规律和基本病机特点，为胡桃散辨证治疗糖尿病大血管病变提供理论依据。 2.利用网络药理学手段分析胡桃散治疗糖尿病大血管病变的潜在靶点和通路。 3.利用动物实验研究胡桃散对糖尿病大血管病变糖脂代谢方面的治疗效果并通过蛋白质组学和转录组学方法探索其可能的作用机制。 方法： 1.通过深圳市中医院医院信息化系统收集2022年1月至2024年1月期间2型糖尿病大血管病变患者的住院病历资料，根据纳入、排除标准进行筛选后统计中医证型、证素分布特点，并对不同证型患者的性别、年龄、糖尿病病程、体重指数(Body mass index，BMI)、糖化血红蛋白(Hemoglobin A1c，HbA1c)、血脂情况进行分析。 2.通过中药系统药理学数据库与分析平台和相关文献中获得胡桃散中桃仁和胡芦巴的有效化合物，并通过SWISSADME平台进行筛选，随后在SwissTarget-Prediction数据库获取化合物靶点。通过GeneCards数据库、OMTM数据、DisGeNET数据库和GEO数据库检索糖尿病大血管病变的疾病靶点，并对药物和疾病靶点取交集后得到胡桃散治疗糖尿病大血管病变的潜在靶点。将上述潜在靶点导入利用Cytoscape3.9.1软件，建立胡桃散-有效化合物-靶点网络，筛选出核心化合物。利用交集靶点在STRING台进行蛋白互作网络的构建，进而筛选出核心靶点，同时利用DAVID数据库对交集靶点进行基因本体论(Gene Ontology，GO)和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，并通过分子对接进行初步验证。 3.40只ApoE-/-小鼠被随机分为动脉粥样硬化组(AS组)、模型组(MOD组)，胡桃散组(HTS组)，阿托伐他汀+二甲双胍组(ATV+MET组)，每组各10只，10只C57BL/6小鼠作为对照组(CON组)。对MOD、HTS、ATV+MET组ApoE-/-小鼠进行腹腔注射建立2型糖尿病动脉粥样硬化模型，CON组予普通饲料饲养，其余各组高脂饲料饲养。HTS组给予每日灌胃胡桃散溶剂4g/kg，ATV+MET组给予二甲双胍100mg/kg，阿托伐他汀10mg/kg，MOD、CON、AS组分别予相同体积去离子水灌胃治疗，灌胃体积为0.1m1/10g。干预14周后，测定小鼠体重、血糖、血脂指标，并取主动脉组织进行蛋白质组学和转录组学分析。 结果： 1.筛选后共获得626例患者临床资料。在糖尿病大血管病变各证型分布中，气虚血瘀证患者最多，占49.84%，而肾阴虚、肾阳虚证患者最少，不足总人数的3%；在证素分析中，病位证素有4个，包括肺、胃、肾、络脉，其中胃、络脉两者者分布频率最高，病性证素有8个，包括血瘀、气虚、阴虚、湿、痰、津液亏虚、火、阳虚，其中血瘀分布频率最高，占39.09%，其次是气虚，占37.84%；各证型性别对比，男性数量总体多于女性，其中气阴两虚挟瘀证男性多于女性、肾阳亏虚证女性多于男性，差别有统计学意义(P＜0.05)，各组证型年龄对比，总体平均年龄为50岁以上，肺胃热盛，阴津亏虚证组年龄最小，肾阴亏虚组年龄较大，二者差别有统计学意义(P＜0.05)；各组糖尿病病程对比，肺胃热盛，阴津亏虚证病程最短，多为1年以下，与肺胃热盛，阴津亏虚证比较，气虚血瘀，湿邪内蕴证、气阴两虚挟瘀证患者糖尿病病程较长，差别有统计学意义(P＜0.05)；各证型患者BMI对比，气虚血瘀，湿邪内蕴证患者最高，与其相比，气虚血瘀证、气阴两虚挟瘀证、肺胃热盛，阴津亏虚证、肾阴亏虚证组患者BMI较低，差别有统计学意义(P＜0.001，P＜0.001，P＜0.05，P＜0.05)；各证型间HbA1c对比，肺胃热盛，阴津亏虚证患者最高，与其相比，气虚血瘀证患者HbA1c较低，差别有统计学意义(P＜0.05)；各证型患者血脂比较，肺胃热盛，阴津亏虚证患者总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇最高，气虚血瘀证、气阴两虚挟瘀证患者较之降低，差别有统计学意义(P＜0.05)；各证型甘油三脂和高密度脂蛋白差别无统计学意义(P＞0.05)。 2.共获得桃仁24个有效化合物，胡芦巴18个有效化合物。胡芦巴和桃仁中化合物靶点共617个，糖尿病大血管病变靶点354个，二者的交集靶点共35个，胡桃散-有效化合物-靶点网络筛选出Mairin、GA120、Amygdalin、quercetin、trigonelline为核心化合物，PPI网络筛选出TNF、VEGFA、ICAM1、MMP9、PPARG为核心靶点，GO分析提示生物过程部分主要涉及PI3K信号的正向调节、MAPK信号级联调节、细胞迁移、缺氧等过程；细胞组成部分主要涉及胞外空间、质膜、细胞外泌体等，分子功能主要涉及蛋白酪氨酸激酶活性、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、内肽酶活性等，KEGG富集主要包含AGE-RAGE信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路、脂质与动脉粥样硬化等。分子对接提示核心靶点与核心化合物对接良好。 3.①血糖指标：胡桃散干预14周后，与MOD组相比，AS、HTS组FBG降低，差别有统计学意义(P＜0.01，P＜0.05)，ATV+MET组FBG变化无统计学差别(P＞0.05)； ②体重指标：与MOD组相比，AS组体重降低，差别有统计学意义(P＜0.05)，HTS、ATV+MET组体重变化无统计学差别(P＞0.05)； ②血脂指标：针对各组小鼠TG，与MOD组相比，AS、HTS、ATV+MET组TG水平较低，差别有统计学意义(P＜0.05，P＜0.05，P=0.05)；小鼠各组TC，与MOD组相比，AS、ATV+MET、HTS组TC水平降低，差别有统计学意义(P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05)；小鼠各组HDL-C，与MOD组相比，AS、ATV+MET组降低，差别有统计学意义(P＜0.001，P＜0.05)，HTS组HDL-C变化无统计学差别(P＞0.05)；小鼠各组LDL-C，与MOD组相比，AS、ATV+MET、HTS组LDL-C降低，差别有统计学意义(P＜0.001，P＜0.01，P＜0.05)； ③主动脉大体油红O染色：与MOD组比较，HTS、ATV+MET组主动脉红染区域稀疏，脂质沉积明显减少； ④蛋白质组学和转录组学：蛋白质组学对差异蛋白KEGG分析提示其作用起作用机制可能与PPAR信号通路、HIF-1信号通路、脂肪消化和吸收、酪氨酸代谢、胰岛素分泌等密切相关，转录组学提示HIF-1信号通路、AMPK信号通路、胰岛素信号通路、PI3K-Akt信号通路等为胡桃散治疗糖尿病大血管病变的关键通路。 结论： 1.糖尿病大血管病变患者“虚”、“瘀”为主要特点。肺胃热盛，阴津亏虚证患者多为新发病的年轻患者，伴有严重的糖脂代谢紊乱，随着糖尿病病程增加，虚证逐渐加重，伴有痰瘀病理产物堆积，出现气虚血瘀，痰湿内蕴证、气阴两虚挟瘀、痰瘀互结各证，且患者糖脂代谢指标控制依然不佳，气虚血瘀证患者仍占据大多数，治疗上补气活血化瘀仍是重中之重。肾阴、肾阳亏虚证患者整体数量较少，但患者病程较长，提示长期病变患者需顾护肾气。针对“虚”、“瘀”的病机特点，胡桃散可补虚化瘀通络，并可配伍不同中药调节阴阳平衡。 2.胡桃散治疗糖尿病大血管病变可能通过AGE-RAGE信号通路、HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路影响糖脂代谢、新生血管和炎症方面来保护内皮细胞功能，达到治疗糖尿病大血管病变。 3.胡桃散能够降低糖尿病动脉粥样硬化小鼠FBG、TG、TC、LDL-C水平，改善糖尿病动脉粥样硬化小鼠的糖脂代谢紊乱，减轻主动脉斑块的形成，其作用机制与HIF-1信号通路密切相关。
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