摘要
目的: 宫颈癌是关乎妇女的一个重大公共卫生问题，尽管有HPV疫苗和宫颈筛查的推广，宫颈癌的发病率和死亡率仍呈现逐年增加的趋势，如何治疗以改善患者预后、提高其生活质量仍是妇产科医生面临的重要问题。中医认为“湿热”是宫颈癌的重要病机之一，“清热祛湿”经常被运用于治疗湿热证的宫颈癌患者。苦参是临床上常见的“清热燥湿”中药，常用于妇科疾病治疗，其有效成分苦参碱以其抗宫颈癌的特性和诱导程序性细胞死亡的能力而闻名。铁死亡是一种新的细胞死亡模式，其与机械敏感离子通道蛋白Piezo1密切相关，有望成为临床治疗肿瘤的有效方法。然而，苦参碱对宫颈癌铁死亡的影响尚不清楚。在本课题中，基于Piezo1通路，研究苦参碱对宫颈癌治疗作用及对其铁死亡的诱导作用与机制。 方法: (1)苦参碱治疗宫颈癌的药效学研究： 采用CB-17重度联合免疫缺陷(Severe combined immunodeficient, SCID)小鼠建立SiHa源性荷瘤小鼠模型，分别给予苦参碱(25、50、75 mg/kg)和顺铂(2 mg/kg)治疗(隔天给药，一共给药12次)，给药期间仔细追踪体重和肿瘤大小的变化，结束后收集小鼠的血清、肿瘤、肝、肾组织。血清用于BUN、CRE、AST、ALT试剂盒检测评估肝肾生化指标；将肝肾制成4μm的石蜡切片，使用苏木素-伊红(H＆E)染色评估肝脏和肾脏的健康状况。培养人源宫颈癌鳞癌SiHa细胞，给予不同梯度浓度的苦参碱(0、0.25、0.5、1、2 mg/mL)干预SiHa细胞24小时，通过MTT法检测苦参碱对细胞活性和毒性的影响以筛选药物干预细胞的有效浓度。后续实验以梯度浓度苦参碱(0、0.5、1、2 mg/mL)干预SiHa细胞24小时，以6μg/mL顺铂为阳性对照药。平板克隆实验检测苦参碱对SiHa细胞增殖能力的影响。LDH试剂盒法检测细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)的含量以评估苦参碱对细胞死亡情况。 (2)苦参碱抑制宫颈癌发展与铁死亡的发生密切相关 利用GEO基因表达数据集(GSE201309)进行GO分析，评估苦参碱对恶性肿瘤细胞的影响与铁死亡之间的关系。采用免疫组化法检测苦参碱对荷瘤小鼠肿瘤中GPX4蛋白的影响，利用亚铁离子检测试剂盒和丙二醛(MDA)试剂盒检测荷瘤小鼠肿瘤中亚铁离子和脂质过氧化物的含量。在细胞上，以梯度浓度苦参碱(0、0.5、1、2 mg/mL)干预SiHa细胞24小时，以6μg/mL顺铂为阳性对照药，铁死亡通路抑制剂Ferrostatin-1(4μM)作为苦参碱激活铁死亡通路的对照药物。使用Westernblotting法检测了苦参碱对SiHa细胞中铁死亡相关蛋白(GPX4、XCT、Tfr、Piezo1)的表达量，FerroOrange荧光探针、Liperfluo荧光探针和DCFH-DA荧光探针分别检测细胞中亚铁离子含量、脂质过氧化物含量和活性氧(Reactive oxygen species, ROS)的表达。试剂盒检测SiHa细胞中GSH的含量。采用细胞热位移法(CETSA)研究了苦参碱与铁死亡相关蛋白(GPX4、XCT、Tfr、Piezo1)的相互作用情况。 (3)苦参碱通过调节Piezo1的活化和钙离子的内流介导宫颈癌铁死亡的发生的机制研究 苦参碱(2 mg/mL)干预SiHa细胞24小时以研究其机制。使用Piezo1特异性小干扰RNA(siRNA)，WB检测GPX4表达及亚铁离子、脂质过氧化物、ROS荧光探针染色用以评价来Piezo1在苦参碱介导的铁死亡中的作用。采用钙显像法研究苦参碱对Piezo1活化的影响。EGTA(1 mM)作为钙离子螯合剂，在苦参碱治疗前10分钟加入。在阻断外环境中钙的情况下，通过WB检测GPX4表达及使用亚铁离子、脂质过氧化物、ROS荧光探针染色用以进一步确认Piezo1在苦参碱介导的铁死亡中的作用。 结果: (1)苦参碱治疗宫颈癌的药效学研究： 在体内实验中，本研究发现苦参碱能在不影响小鼠体重和肝肾组织的情况下抑制宫颈癌肿瘤的生长，肿瘤的大小及重量与PBS对照组相比有统计学差异，药效随着浓度增加而增强。同时，在体外实验中，MTT和平板克隆实验结果证明，苦参碱能抑制进体外SiHa细胞生长增殖，药效呈浓度依赖性，在0.5mg/mL的浓度时，与PBS对照组相比就有统计学差异，通过计算发现半数抑制浓度IC50在2.524mg/mL。LDH测试的结果显示苦参碱干预后SiHa细胞上清液中LDH含量增加，在浓度为1mg/mL时，与PBS对照组相比开始出现统计学差异，提示苦参碱可诱导SiHa细胞发生死亡。 (2)苦参碱抑制宫颈癌发展与铁死亡的发生密切相关： GEO数据集的分析结果表明，苦参碱能影响血液学恶性肿瘤细胞U937中脂质生物合成过程和铁离子转运等生物学过程，提示在肿瘤细胞中苦参碱确实参与了铁死亡发生的过程。然后使用在药效学研究中获得的肿瘤组织进行验证，IHC结果显示用苦参碱治疗后的宫颈癌肿瘤的GPX4蛋白水平显著降低，同时试剂盒检测结果显示其脂质过氧化物和Fe2+含量增加，提示苦参碱可诱导宫颈癌发生铁死亡。在细胞上，WB数据显示苦参碱干预后，SiHa细胞中GPX4蛋白表达降低，同时细胞内Fe2+、脂质过氧化物和ROS的荧光程度增加，铁死亡抑制剂可以逆转苦参碱的作用，进一步证明了苦参碱对宫颈癌铁死亡的激活作用。因此，本研究进一步探讨苦参碱是如何诱导铁死亡的。有趣的是，本研究发现苦参碱对SiHa细胞的GSH、SystemXc-(xCT)和转铁蛋白受体(Tfr)这三个经典上游没有显著的影响，CETSA数据显示苦参碱也不与xCT和Tfr相互结合。反而在苦参碱的作用下，Piezo1蛋白的表达显著上调，且与苦参碱发生明显结合，提示苦参碱可能通过作用于Piezo1而非xCT或Tfr，从而介导铁死亡的发生。 (3)苦参碱通过调节Piezo1的活化和钙离子的内流介导宫颈癌铁死亡的发生的机制研究 本研究进一步提供了苦参碱-Piezo1-铁死亡三者关系的证据，通过使用实时Ca2+成像技术结合和Piezo1激动剂(Yoda1)，发现苦参碱可以通过激活Piezo1通道诱导钙内流。为近一步研究Piezo1与苦参碱诱导的铁死亡的关系，在SiHa细胞中转染Piezo1siRNA，苦参碱诱导的GPX4蛋白表达下降和细胞内Fe2+、脂质过氧化物和ROS的增加都得到了逆转。说明苦参碱确实是通过作用于Piezo1起到诱导宫颈癌铁死亡的。此外，加入EGTA阻断细胞外钙后，苦参碱不再引起铁死亡相关指标的变化。这进一步说明了，苦参碱诱导的宫颈癌铁死亡与Piezo1的激活密不可分。 结论： (1)苦参碱能够在不伤害机体的情况下通过诱导癌细胞铁死亡对宫颈癌起抑制作用。 (2)苦参碱可以通过激活Piezo1引起钙内流而激活的宫颈癌铁死亡。
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